ICS 65.020.20 B 38 DB3308 衢 州 市 地 方 标 准 规 范 DB3308/T 031—2016 金线莲组培苗生产技术规程 Seedling Production Technology Regulation of Anoectochilus Formosanus Plantlets 2016-07-29 发布 衢州市质量技术监督局 2016-08-29 实施 发布 DB3308/T 031—2016 前 言 本标准依据GB/T 1.1的规则起草和编制。 本标准由衢州市三易易生态农业科技有限公司和衢州市衢江区嘉利果蔬专业合作社提出并起草。 本标准附录A为资料性附录。 本标准主要起草人：蒋张明、徐应英、陈振华、管宇、毛正荣、吴梅、祝火清。 本标准为首次制定。 I DB3308/T 031—2016 金线莲组培苗生产技术规程 1 范围 本标准规定金线莲组培苗生产技术规程的术语和定义、生产设备（施）及化学试剂、消毒灭菌操作 规程、培养室环境调控、组培苗生产操作规程。 本标准适用于浙江省衢州市金线莲组培苗生产。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本部分的引用而构成本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的 修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用 于本部分。 GB4285 农药安全使用标准 GB5084 农田浇灌水质标准 GB/T 8321.1-9 农药合理使用标准 《中药材生产质量管理规范》 （试行） （二〇〇二年版）（局令第 32 号） 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 金线莲 Anoectochilus roburghii 兰科开唇兰属植物花叶开唇兰 Anoectochilus roburghii (Wall.) Lindl 的植株或全草。 3.2 植物组织培养 Plant tissue culture 是指在无菌条件下，将离体的植物器官（如根、茎、叶、花、果实、种子等）、组织（如形成层、 花药组织、胚乳、皮层等）、细胞（体细胞和生殖细胞）以及原生质体，接种到人工配制的培养基上， 给予适当的培养条件，使它们得以继续生长、分化、形成完整植株的过程。 3.3 金线莲组培苗 Anoectochilus roburghii Plantlets 以植物组织培养方法进行繁殖的金线莲称金线莲组培苗。 3.4 植物生长物质 Plant growth substance 指一些调节植物生长发育的物质，包括植物激素和植物生长调节剂。 1 DB3308/T 031—2016 3.5 外植体 Explant 用于组织培养的组织、器官、细胞及原生质体称为外植体。 3.6 培养材料 Culture materials 生长在培养容器内培养基上的植物材料统称培养材料。 3.7 培养基 Medium 在植物组织培养过程中，由人工配制的提供培养材料生长所必需的营养元素和某些生理活性物质的 基质。 3.8 接种 Inoculation 将外植体经消毒灭菌后，在无菌条件下放入培养容器内培养基上的过程。 3.9 增殖 Proliferation 指外植体或继代组培苗产生出新的具有特定结构和功能的组织或器官的现象。 3.10 继代 Subculture 是指培养过程中将培养材料周期性地分株、分割、剪截等转接于新鲜培养基上进行增殖的过程。 4 生产设备（施）及化学试剂 4.1 生产设备（施） 4.1.1 建筑设施 设计组培实验室或小型组培工厂必须选择环境幽静、无污染的地方并保证其生产过程中不对周围 环境造成污染。实验室或组培工厂各部分的配置要合理，做到工作方便、使用安全、节省能源。房屋设 计包括配置室、接种室、培养室、洗涤室、实验室、贮存室、温室，另外可配置办公室、更衣室等。 4.1.2 生产设备 4.1.2.1 洗涤设备 工厂化生产可选用自动或半自动洗瓶机，实验室或小型车间选用普通洗涤用具，如洗涤室水槽、 塑料盆、塑料桶、塑料箱等，人工洗涤。另外配置干燥箱、晾瓶架等。 4.1.2.2 灭菌设备 高压蒸汽灭菌锅（大型卧式、中型立式、小型手提式）、接种器械灭菌器、熔锡炉、紫外灯、烘 干箱、微滤孔器、臭氧发生器等。 2 DB3308/T 031—2016 4.1.2.3 接种设备及工具 超净工作台、镊子、剪刀等。 4.1.2.4 培养设备 培养瓶、培养架、空调、新风系统、除湿机等。 4.1.2.5 试验设备 冰箱、纯水仪、电子天平、分析天平、pH 5.0～7.0 精密试纸、pH 计、温湿度计、照度计、盛装 器皿（烧杯、试剂瓶等）、计量器皿（量筒、容量瓶、移液管、移液枪等）以及其他实验室常用器具等。 4.1.2.6 细胞学观察设备 高倍显微镜。 4.2 常用化学试剂 4.2.1 洗涤剂 选用环境友好的洗衣粉、洗洁精、去污粉等。 4.2.2 灭菌剂 选用酒精、氯化汞、高锰酸钾、甲醛、过氧乙酸、新洁尔灭、来苏水、抗菌素等。 4.2.3 无机盐类和有机物类 常用培养基如 MS、B9、N6 等大量元素和微量元素所规定的无机盐类和有机物类；或者根据试管苗生 产所用培养基种类购置所需化学试剂。常见培养基成分见附录 A。 4.2.4 植物生长物质 细胞分裂素：6-苄基氨基嘌呤（6-BA）、激动素（KT）、玉米素（ZT）、2-异戊烯腺嘌呤（2IP） 等。 细胞生长素：吲哚丁酸（IBA）、萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D) 等。 赤霉素：GA3 等。 乙烯：C2H4。 4.2.5 碳水化合物 蔗糖或食用砂糖。 4.2.6 固化剂 可选用以下任何一种：组培专用培养基固化剂、微生物多糖固化剂、琼脂等。 4.2.7 培养基附加成分 为促进试管苗的生长，有时培养基中还可加入以下附加成分，氨基酸、蛋白胨、300 mg/L～500 mg/L 水解乳蛋白（LH）、200 mg/L～500 mg/L 水解酪蛋白（CH）以及 1 mg/L～80 mg/L 腺嘌呤(ADE)。 5 消毒灭菌操作规程 3 DB3308/T 031—2016 5.1 洗涤室 每天用来苏打水、过氧乙酸等喷洒地面，保持室内清洁。 5.2 接种室 接种前用紫外灯照射 20 min～30 min，并定期(一般 60 d)用高锰酸钾及甲醛以 2：1 比例混合薰 蒸。 5.3 培养室 一般 60 d 左右用高锰酸钾及甲醛混合薰蒸。 5.4 超净工作台 在无菌操作过程中，工作人员严格按照无菌操作的要求，规范熟练地完成好每一个步骤，有效减 少由操作引起的污染。 （1）接种前，工作人员的双手必须用肥皂水洗净，进入接种室后换上工作服、戴 上口罩，用 75%的酒精擦拭消毒双手； （2）接种前用紫外灯照射 20 min～30 min，75%的酒精擦拭超净 工作台，包括灯管表面及灯管之间的凹处，以防灰尘积聚掉落造成操作感染；定期清洗超净工作台过滤 膜以保证过滤膜清洁；接种工具（如剪刀、手术刀、镊子等）使用前要在 75%酒精中浸泡，再在器械 灭菌器上高温灭菌，冷却后使用。 5.5 培养基 培养瓶、试管等容器和封口用的盖子、耐高温的塑料膜等物品在用前要经过彻底清洗、晾干。配 制好的培养基分装后应立即高压蒸汽灭菌，即在 1.1 kg/cm2 的压力，锅内温度达到 121 ℃，持续保持 20 min～30 min。 5.6 接种器具 接种前后采用接种器械灭菌器进行消毒灭菌。 5.7 污染容器 彻底清洗培养容器，再用消毒锅高温高压消毒。 6 培养室环境调控 6.1 温度 有光照条件下控制在 25 ℃±2 ℃，无光照条件下控制在 20 ℃±2 ℃。 6.2 湿度 维持室内相对湿度在50%以下。 6.3 光照 一般培养室光照强度控制在 3000 lux～5000 lux，增殖苗前 10 d 暗培养，生根苗每天光照 12 h。 7 组培苗生产操作规程 7.1 培养基的配制 7.1.1 培养基的选择 4 DB3308/T 031—2016 根据培养材料生长发育特性选择合适的基本培养基种类和激素配比，常见培养基见附录 A。 7.1.2 母液的配制和保存 7.1.2.1 母液的配制 根据生产情况，母液可以配制成单一化合物母液，也可以配制成几种化合物的混合母液。大量元素 母液配制 50 倍，微量元素母液配制 100 倍，植物生长物质配制浓度 0.5 mg/mL～1.0 mg/mL。 7.1.2.2 母液的保存 母液配制好后，置于 4 ℃的冰箱中冷藏。 7.1.2.3 培养基的配制程序 准备好母液、蒸馏水、蔗糖、固化剂等，按以下程序制作： 蒸馏水+母液+糖+固化剂+蛋白胨+活性炭+香蕉—pH 调整（5.6～6.0）—分装—封口—灭菌—凝固。 7.2 培养材料及消毒 7.2.1 培养材料的选择和确定 选取生长健壮、无病虫害、能保证原品种优良性状的金线莲的完整植株，剪去叶片和根，选取带节 的 1 cm 左右茎段作为外植体。 7.2.2 外植体 茎段的消毒：75%酒精浸泡数秒钟，无菌水冲洗 2 次～3 次，再用 0.5%～2%的次氯酸钠浸泡 10 min～ 15 min，用无菌水冲洗 3 次后接种。继代培养不需要。 7.3 初代培养 7.3.1 初代(诱导)培养基 MS + 1.5 mg/L 6-BA + 0.15 mg/L NAA 为金线莲组培苗常用初代培养基。 7.3.2 外植体的接种 培养材料经过消毒后，以茎节为单位，剪落到培养基中。 7.3 增殖与继代培养 金线莲组培苗的不断增殖通过周期性的继代培养来实现，继代培养周期根据培养苗种类及生长情 况而定，一般100 d～110 d，继代培养1次。 7.5 金线莲组培苗炼苗移栽 7.5.1 炼苗 提前 15 d 从培养室挑选适合种植的瓶苗（株高 10 cm～15 cm）到大棚炼苗 7 d～14 d，培养架上剩 余瓶苗集中摆放整齐，种植前两天傍晚打开瓶塞。 7.5.2 移栽 用镊子将金线莲从培养瓶中取出，洗去基部培养基，在 800 倍恶霉灵（可湿性粉剂）溶液或者 1000 倍多菌灵（可湿性粉剂）溶液中浸泡 2 min 后移栽到基质中。按泥炭土：木屑：沙=2.5：2：1 的比例 配制基质。控制温度 25 ℃±2 ℃，相对湿度前期 60%～80%，以后逐渐降低湿度。 5 DB3308/T 031—2016 7.6 移栽苗管理 7.6.1 肥水管理 金线莲组培苗的基质不宜太湿，透气性强，以攥在手中指间不滴水为原则，日常管理中以基质表面 1 cm 干燥后再浇水为宜，浇水时避开夏天高温时段。浇灌用水要符合 GB5084 标准。 7.6.2 病虫害防治 7.6.2.1 防治原则 预防为主，综合防治。按照病虫害发生的特点，以农业防治为基础，综合利用物