(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 20221045415 3.8 (22)申请日 2022.04.27 (71)申请人 江西烈冰生物科技有限公司 地址 334000 江西省上饶市信州区上饶大 道18号6幢1-1,1-2 (72)发明人 陈岱　 (51)Int.Cl. C12Q 1/6806(2018.01) C12Q 1/6886(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/6844(2018.01) (54)发明名称 一种基于高密度空间点阵的原位基因突变 靶向检测方法 (57)摘要 本发明公布了一种基于高密度空间点阵的 原位基因突变靶向检测方法， 具体包括以下内 容： 通过高密度点阵技术捕获RNA(尤其是蛋白质 编码相关的mRNA)的具体信息； 捕获后的RNA在反 转录后形成全长DNA， 以此为模板， 通过提前设计 好的通用引物进行扩增， 在5端和3端引入提前设 计好的接头序列及粘性末端； 通过T4连接酶可以 将DNA产物连接形成环化DNA； 以的环化DNA为模 板， 通过针对不同DNA突变位点而设计的引物进 行扩增， 产物的5端和3端引入提前设计好的高通 量测序接头序列； 完成高通量测序文库构建， 并 上机测序。 本发明提供的方法针对病理组织切 片， 可以同时完成该样本的RNA和DNA捕获。 权利要求书1页 说明书2页 CN 114752654 A 2022.07.15 CN 114752654 A 1.一种基于高密度空间点阵的原位基因突变靶向检测方法， 其特征在于， 具体包括以 下步骤： (1)通过高密度点阵技 术捕获RNA(尤其是蛋白质编码相关的mRNA)的具体信息； (2)捕获后的RNA在反转录后形成全长DNA， 以此为模板， 通过提前设计好的通用引物进 行扩增， 在5端和3端引入提前设计好的接 头序列及粘性末端； (3)通过T4连接酶可以将步骤(2)中的DNA产物连接形成环化DNA； (4)以步骤(3)中的环化DNA为模板， 通过针对不同DNA突变位点而设计的引物进行扩 增， 产物的5端和3端引入提前设计好的高通 量测序接 头序列； (5)以步骤(4)的产物为模板， 完成高通 量测序文库构建， 并上机测序。 2.根据权利要求1所述的一种基于高密度空间点阵的原位基因突变靶向检测方法， 其 特征在于： 所述 步骤(1)中通过高密度点阵技 术捕获RNA具体信息的方法为： 1)将冰冻组织切片或石蜡包埋的组织切片， 组织切片的厚度为8 ‑10um； 2)切片平铺于高密度点阵技 术制备的玻璃片表面； 3)通过处 理液对组织切片表面进行透化处 理， 暴露细胞内的RNA； 4)通过高密度点阵中核酸捕获探针的po lydT结果， 识别并捕获细胞内的RNA。 3.根据权利要求2所述的一种基于高密度空间点阵的原位基因突变靶向检测方法， 其 特征在于： 所述处 理液为盐酸及蛋白酶。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114752654 A 2一种基于高密 度空间点阵的原位基因 突变靶向检测方 法 技术领域 [0001]本发明涉及基 因突变检测技术领域， 具体为一种基于高密度空间点阵的原位基 因 突变靶向检测方法。 背景技术 [0002]生活中许多疾病的治疗都涉及到基因层次， 例如癌症的治疗。 而此类疾病多采用 靶向治疗的方式。 靶向治疗， 是在细胞分子水平上， 针对已经明确的致癌位点的治疗方式 (该位点可以是肿瘤细胞内部的一个蛋白分子， 也可以是一个基因片段)。 可设计相应的治 疗药物， 药物进入体内会特异地选择致癌位点来相结合发生作用， 使肿瘤.特异性死亡， 而 不会波及肿瘤周围的正常组织细胞， 所以分子靶向治疗又被称为"生物导弹"。 患者在进行 靶向治疗前需要进行靶向检测从而确定基因突变情况， 但现有的靶向检测方法需要先判定 组织切片 中病理情况， 然后再通过其他方法进行基因突变信息进行检测， 两者需要进行分 开操作。 发明内容 [0003]本发明所解决的技术问题在于提供一种基于高密度空间点阵的原位基因突变靶 向检测方法， 以解决上述背景技 术中的问题。 [0004]本发明所解决的技术问题采用以下技术方案来实现： 一种基于高密度空间点阵的 原位基因突变靶向检测方法， 具体包括以下步骤： [0005](1)通过高密度点阵技 术捕获RNA(尤其是蛋白质编码相关的mRNA)的具体信息； [0006](2)捕获后的RNA在反转录后形成全长DNA， 以此为模板， 通过提前设计好的通用引 物进行扩增， 在5端和3端引入提前设计好的接 头序列及粘性末端； [0007](3)通过T4连接酶可以将步骤(2)中的DNA产物连接形成环化DNA； [0008](4)以步骤(3)中的环化DNA为模板， 通过针对不同DNA突变位点而设计的引物进行 扩增， 产物的5端和3端引入提前设计好的高通 量测序接 头序列； [0009](5)以步骤(4)的产物为模板， 完成高通 量测序文库构建， 并上机测序。 [0010]优选地， 所述 步骤(1)中通过高密度点阵技 术捕获RNA具体信息的方法为： [0011]1)将冰冻组织切片或石蜡包埋的组织切片， 组织切片的厚度为8 ‑10um； [0012]2)切片平铺于高密度点阵技 术制备的玻璃片表面； [0013]3)通过处 理液对组织切片表面进行透化处 理， 暴露细胞内的RNA； [0014]4)通过高密度点阵中核酸捕获探针的po lydT结果， 识别并捕获细胞内的RNA。 [0015]优选地， 所述处 理液为盐酸及蛋白酶。 [0016]与现有技术相比， 本发明具有以下优点及有益效果： 本发明提供的方法针对病理 组织切片， 可以同时完成该样 本的RNA和DNA信息捕获； 通过后续生物信息学分析， 可以在 对 病理切片进行病理分级、 细胞类型判定的同时， 还可以得到关键DNA突变情况(也可以根据 研究者需求定制化设计)； 可以针对不同人类疾病的病理组织切片(尤其是肿瘤)进行检测说　明　书 1/2 页 3 CN 114752654 A 3