ICS 65.020.20 B 21 DB13 河 北 省 地 方 标 准 DB 13/T 5112—2019 棉花杂交种真实性和纯度检测技术规程 SSR 分子标记法 2019 - 11 - 28 发布 河北省市场监督管理局 2019 - 12 - 28 实施 发 布 DB13/T 5112—2019 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由河北省农林科学院提出。 本标准起草单位：河北省农林科学院棉花研究所。 本标准主要起草人：张建宏、田海燕、唐丽媛、张素君、崔瑞敏、张香云、刘存敬、李兴河、王 海涛。 I DB13/T 5112—2019 棉花杂交种真实性和纯度检测技术规程 SSR 分子标记法 1 范围 本标准规定了利用简单重复序列（simple sequence repeats，SSR）分子标记进行棉花杂交种真 实性和纯度检测的术语和定义、原理、仪器设备、试剂及溶液配制、引物、样品准备、操作步骤、真 实性检测和纯度检测。 本标准适用于基于SSR分子标记的棉花杂交种真实性和纯度检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注明日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本 文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 3543.2 农作物种子检验规程 扦样 GB/T 3543.4 农作物种子检验规程 发芽试验 GB 4407.1 经济作物种子 纤维类 NY/T 1385 棉花种子快速发芽试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 品种真实性 varietal genuineness 是指本标准中供检样品在DNA分子标记带型上与标准样品的一致性（差异位点数≤2）。 3.2 品种纯度 varietal purity 供检样品中真实性种子占供检样品的百分率。 3.3 SSR分子标记 simple sequence repeats 是指由几个核苷酸（一般为2～6个）为重复单元的多达几十至几百次的串联重复，由于基本单元 重复次数的不同，进而形成SSR座位的多态性，根据SSR座位两侧保守的单拷贝序列设计一对特异引物 来扩增SSR序列，即可揭示其多态性。 3.4 核心引物 core primer 1 DB13/T 5112—2019 指品种DNA鉴定优先选用的一套SSR引物，具有多态性高、重复性好等综合特性，可用于品种DNA 真实性和纯度检测。 3.5 标准样品 standard sample 代表已知品种特征特性的F1代种子。 4 原理 SSR广泛分布于基因组中，不同品种间每个SSR位点重复单位的数量可能不同。根据SSR序列两端保 守的单拷贝序列设计特异引物，利用聚合酶链式反应（PCR）技术对重复序列进行扩增和电泳分析，获 得样品单株的SSR电泳带型。将受检样品与标准样品的带型进行差异比较和分析，通过棉花杂交种SSR 检测来判定品种的真实性和纯度。 5 仪器设备、试剂及溶液配制、引物 仪器设备见附录Ⅰ，试剂及溶液配制见附录Ⅱ，引物相关信息见附录Ⅲ。 6 样品准备 受检样品和标准样品均采集棉花的幼嫩叶片。标准样品纯度应符合GB 4407.1的规定，种子扦样按 GB/T 3543.2的规定执行，种子发芽按GB/T 3543.4、NY/T 1385的规定执行。 以受检样品所标注品种的标准样品作为对照，同时检测受检样品和标准样品。真实性检测需标准 样品和受检样品的种子或单株，各12粒（株），品种纯度检测需受检样品的F1种子或单株80粒（株）。 7 操作步骤 DNA提取、PCR扩增、PCR产物检测具体试验操作步骤见附录IV。 8 棉花杂交种真实性检测 在36对核心引物中，按照染色体随机选择26对引物进行扩增，比较受检样品和标准样品在每个位 点的异同。 8.1 差异位点比较与判读 8.1.1 某核心引物在受检样品和标准样品间所扩增出的条带类型完全一致，表现为无差异带型，记为 相同位点。 8.1.2 某核心引物在受检样品和标准样品间扩增出的条带不完全一致，当表现异类型的单株数≤2 时，该差异带型为偶然差异带型，记为疑似相同位点。 8.1.3 某核心引物在受检样品和标准样品间扩增出的条带不完全一致，当表现异类型的单株数＞2 时，该差异带型为异带型，记为差异位点。 2 DB13/T 5112—2019 8.2 结果判定 采用差异位点数来判断棉花杂交种的真实性。按8.1的方法分别统计受检样品和标准样品在26对核 心引物上表现出的相同位点数、疑似相同位点数和差异位点数，当差异位点数＞2时，判定为F1不真实， 混杂了其他品种或亲本；当差异位点数≤2时，判定为F1真实。 9 棉花杂交种纯度检测 采用品种纯度来表示棉花杂交种的纯度。利用15对核心引物检测至少80个受检样品，统计每对核 心引物扩增时出现差异带型的样品号。每个样品电泳谱带与标准谱带不一致的位点数≤2，则判定为真 实株；电泳谱带与标准谱带不一致的位点数＞2，则判定为杂株。 3 DB13/T 5112—2019 附 录 A （规范性附录） 仪器设备 A.1 一般选用以下仪器、设备： ---PCR 扩增仪； ---电泳检测系统：电泳仪、电泳槽及配套的制胶附件； ---高速离心机； ---高通量组织研磨仪； ---恒温水浴锅； ---电子天平（精度 1/10000）； ---单道微量移液器：10 L、20 L、100 L、200 L、1000 L； ---多道微量移液器：8 道或 12 道，10 L； ---微量紫外分光光度计； ---水平摇床； ---胶片观察灯； ---高压灭菌锅； ---酸度计； ---制冰机； ---冰箱。 4 DB13/T 5112—2019 附 录 B （规范性附录） 试剂及溶液配制 B.1 试剂 除非另有说明，在实验操作中均使用分析纯的试剂。 a) -巯基乙醇（C2H6OS）； b) 十六烷基三甲基溴化铵 (C19H42BrN)； c) 乙二胺四乙酸二钠 (C10H14N2Na2O8)； d) 聚乙烯吡咯烷酮 [(C6H9NO)n]； e) 三羟甲基氨基甲烷 (C4H11NO3)； f) 二乙基二硫代氨基甲酸 [(C2H5)2NCSSNa·3H2O]； g) 三氯甲烷 (氯仿)（CHCl3）； h) 异戊醇（C5H12O）； i) 异丙醇（C3H8O）； j) 氯化钠（NaCl）； k) 氢氧化钠（NaOH）； l) 浓盐酸（HCl）； m) 葡糖糖（C6H12O6）； n) 无水乙醇（C2H6O）； o) 硼酸（H3BO3）； p) SSR 引物； q) dNTP； r) Taq DNA 聚合酶； s) 丙烯酰胺 (C3H5NO)； t) 甲叉双丙烯酰胺 [(H2C=CHCONH)2CH2]； u) 四甲基乙二胺 [(CH3)2NCH2CH2N(CH3)2]； v) 琼脂糖； w) 过硫酸铵[(NH4)2S2O8]； x) 乙酸（CH3COOH）； y) 硝酸银（AgNO3）； z) 甲醛（CH2O）。 B.2 溶液配制 B.2.1 1 mol/L 三羟甲基氨基甲烷—盐酸溶液（Tris-Hcl）（pH 8.0） 称取121.1 g三羟甲基氨基甲烷溶解于800 mL水中，用盐酸调pH至8.0，加水定容至1000 mL。在103.4 kPa（121℃）条件下灭菌20 min，4℃储存。 5 DB13/T 5112—2019 B.2.2 4 mo l/L 氢氧化钠溶液（NaOH） 在80 mL水中加入16.0 g氢氧化钠，溶解后冷却至室温，再加水定容至100 mL。 B.2.3 0.5 mol/L 乙二胺四乙酸二钠溶液（EDTA—Na2）（pH8.0） 称取187.6 g乙二胺四乙酸二钠加入到800 mL水中，再加入适量氢氧化钠溶液，加热至完全溶解， 冷却至室温，用4 mol/L氢氧化钠溶液调pH至8.0，加水定容至1000 mL。在103.4 kPa（121℃）条件下 灭菌20 min，4℃储存。 B.2.4 DNA 提取缓冲液 分别称取葡萄糖69.3 g、聚乙烯吡咯烷酮20.0 g、二乙基二硫代氨基甲酸1g ，溶解于500 mL水中， 再分别加入100 mL 1 mol/L Tris-Hcl（pH 8.0）溶液、10 mL 0.5 mol/L EDTA—Na2（pH 8.0）溶液， 定容至1000 mL。在103.4 kPa（121℃）条件下灭菌20 min，4℃储存。 B.2.5 DNA 裂解缓冲液 分别称取氯化钠81.7 g、聚乙烯吡咯烷酮20.0 g、十六烷基三甲基溴化铵20.0 g、二乙基二硫代氨 基甲酸（DIECA）1.0 g，溶于500 mL水中，再分别加入100 mL 1 mol/L Tris-Hcl（pH 8.0）溶液、40 mL 0.5 mol/L EDTA—Na2（pH 8.0）溶液，定容至1000 mL。在103.4 kPa（121℃）条件下灭菌20 min，4℃ 储存。 B.2.6 氯仿—异戊醇混合液 氯仿和异戊醇按照体积比24：1配制。 B.2.7 70 %乙醇溶液 量取70 mL无水乙醇，加水定容至100 mL。 B.2.8 TE 缓冲液 分别量取5 mL Tris-Hcl（pH8.0）溶液和1 mL EDTA—Na2（pH 8.0）溶液，定容至500 mL，在103.4 kPa（121℃）条件下灭菌20 min，4℃储存。 B.2.9 SSR 引物工作液 用超纯水分别将正向引物和反向引物配制成浓度为10 mol/L的工作液。 B.2.10 5×三羟甲基氨基甲烷/硼酸电泳缓冲液（5×TBE） 分别称取三羟甲基氨基甲烷50.0 g、硼酸27.5 g溶于500 mL水中，再加入10 mL 0.5 mol/L EDTA—Na2 （pH 8.0）溶液，充分溶解，室温储存。 B.2.11 30 % 丙烯酰胺 分别称取丙烯酰胺290 g、甲叉双丙烯酰胺10 g，溶于600 mL水中，室温充分溶解后，定容至1000 mL， 用0.45 mm滤器滤去杂质，置于棕色瓶中4℃储存。 B.2.12 10 %过硫酸铵溶液 称取过硫酸铵10.0 g溶于100 mL水中，4℃储存。 6 DB13/T 5112—2019 B.2.13 固定液 量取680 mL水，加入80 mL无水乙醇和40 mL乙酸，根据胶板数量调整固定液的量，现用现配。 B.2.14 渗透液 在1000 mL水中加入1.0 g硝酸银（AgNO3）充分混匀，根据胶板数量调整染色液的量，现用现配。 B.2.15 显影液 在1000 mL水中加入10 g氢氧化钠和5 mL甲醛，根据胶板数量调整显影液的量，现用现配。