ICS 65.020.20 B 05 DB22 吉 林 省 地 方 标 准 DB 22/T 2988—2019 白灵菇和杏鲍菇菌种真实性鉴定 ITS-RFLP 法 Verification of genuineness for Pleurotus tuoliensis and Pleurotus eryngii strain—ITS-RFLP 2019 - 05 - 27 发布 吉林省市场监督管理厅 2019 - 06 - 17 实施 发 布 DB22/T 2988—2019 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009 和 GB/T 20001.4-2015给出的规则起草。 本标准由吉林省农业农村厅提出并归口。 本标准起草单位：吉林省农业科学院。 本标准主要起草人：温嘉伟、杨云贵、张维东、谭笑、黄枭、刘迎春、杨大海、滕星、姚丽影、谢 江波。 I DB22/T 2988—2019 白灵菇和杏鲍菇菌种真实性鉴定 ITS-RFLP 法 1 范围 本标准规定了白灵菇和杏鲍菇菌种真实性鉴定ITS-RFLP法的原理、试验条件、试剂、设备仪器、样 品、试验步骤、试验数据处理、试验报告。 本标准适用于白灵菇和杏鲍菇菌种（母种、原种和栽培种）真实性检测和鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 8979-2008 纯氮、高纯氮和超纯氮 NY/T 1730-2009 食用菌菌种真实性鉴定 ISSR法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 ITS-RFLP internal transcribed spacer – restriction fragment length polymorphism 内转录间隔区-限制性片段长度多态性。 3.2 白灵菇 Pleurotus eryngii var.tuoliensis C.J.Mou 侧耳属，刺芹侧耳变种或亚种，子实体通体白色。（GB/T - 12728） 3.3 杏鲍菇 Pleurotus eryngii 又名刺芹侧耳，菌柄白色，菌盖灰褐色。 3.4 PCR 扩增 polymerase chain reaction 聚合酶链式反应。 4 原理 利用真菌内转录区域保守的引物 ITS1 和 ITS4，扩增真菌内转录区域，然后对 PCR 产物进行酶切， 根据酶切片段大小对白灵菇和杏鲍菇菌种真实性进行鉴定。 5 试验条件 1 DB22/T 2988—2019 DNA提取、PCR反应体系配制、PCR扩增、电泳等功能区域应采取分区操作，避免交叉感染。 6 试剂与材料 除非另有说明，在分析中仅适用分析纯试剂和去离子水或相当纯度的水。 6.1 超纯水（ddH2O）：符合 GB/T 6682 规定的二级水，密封、4 ℃ 保存。 6.2 10 mol/L 氢氧化钠溶液：在 160 mL 水中加入 80.0 g 氢氧化钠（NaOH），溶解后，冷却至室温， 再加水定容至 200 mL。 6.3 500 mmol/L 乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）溶液（pH 8.0）：称取 18.6 g 乙二胺四乙酸二钠， 加入 70 mL 水中，缓慢滴加氢氧化钠溶液（见 6.4）直至 EDTA-Na2 完全溶解，用氢氧化钠溶液（见 6.4） 调 pH 至 8.0，加水定容至 100 mL。在 103.4 kPa (121 ℃)条件下灭菌 20 min。 6.4 1 mol/L 三羟甲基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCL）溶液（pH 8.0）：称取 121.1 g 三羟甲基氨基甲 烷溶解于 800 mL 水中，用盐酸调 pH 至 8.0，加水定容至 1000 mL。在 103.4 kPa (121 ℃)条件下 灭菌 20 min。 6.5 1.5 mol/L 氯化钠（NaCL）溶液：在 160 mL 水中加入 17.6 g 氯化钠，溶解后，冷却至室温， 再加水定容至 200 mL。 6.6 三氯甲烷（CHCL3）：避光、密封、4 ℃ 保存。； 6.7 异戊醇（C5H12O）：避光、密封、4 ℃ 保存。 6.8 乙醇(C2H6O)：密封、室温保存。 6.9 dNTPs 混合溶液：将浓度为 10 mmol/L 的 dATP、dTTP、dGTP、dCTP 四种脱氧核糖核苷酸溶液等 体积混合。避光、密封、-20 ℃ 保存。 6.10 高保真度的 Taq DNA 聚合酶、PCR 反应缓冲液及 25 mmol/L 氯化镁溶液。 6.11 核酸染料：避光、密封、4 ℃ 保存。 6.12 DraI 酶：避光、密封、-20 ℃ 保存。 6.13 液氮：应符合 GB/T 8979-2008 中的纯氮级别。 6.14 PDA 液体培养基(配方见附录 A.1) 。 6.15 DNA 提取液（配方见附录 A.2）。 6.16 TAE 电泳缓冲液(参照 NY/T 1730-2009 中 4.6 执行，配方见附录 A.3) 。 6.17 TE 缓冲液（配方见附录 A.4）。 7 仪器设备 7.1 7.2 7.3 7.4 7.5 7.6 7.7 7.8 7.9 8 凝胶成像仪：最低像素不小于 1390×1040。 电泳仪：尺寸 197 mm×96 mm×100 mm。 PCR 仪：温度精度 ≤±0.1 ℃（55 ℃）≤±0.2 ℃（90 ℃ 以上），96 孔样品通道。 移液器：量程范围在 1 ul-1000 ul。 低温离心机：温度参数范围应满足 0 ℃～4 ℃ 需求，转数达到 15000 r/min。 恒温水浴锅：温度参数范围应满足 28 ℃～40 ℃ 需求。 生化培养箱：温度参数范围应满足 18 ℃～28 ℃ 需求。 超净工作台：空间净化指数达到对于粒径 ≥0.5 μm 的尘埃 ≤3.5 颗/升。 冰箱：温度参数范围应满足 -20 ℃～ 4 ℃ 需求。 样品 2 DB22/T 2988—2019 8.1 取样 母种、原种和栽培种的菌丝体。 8.2 制备与保存 将供检菌种在相同条件下培养，培养量可供做 3 个平行试验。 无菌条件下，将斜面培养基上的菌株接种至 100 mL 装有 40 mL PDA 液体培养基的三角瓶中,接种 2 2 菌块面积 0.3 cm ～0.5 cm ，23 ℃ 恒温条件下，暗光、120 r/min 震荡培养 7 天 ～ 10 天，菌球 达到直径小于 2 cm，呈球状后取出置于 4 ℃ 冰箱内保存备用。 9 试验步骤 9.1 DNA 提取 9.1.1 菌株 DNA 提取 9.1.1.1 用滤纸吸干菌球表面水分后，再用液氮快速研磨菌球至粉末状。 9.1.1.2 将 0.3 g 菌球粉末装至 1.5 mL 离心管， 加入 DNA 提取液 0.6 mL（配方见附录 A.1），37 ℃ 条件下水浴 30 min。 9.1.1.3 加入 0.2 mL 的氯化钠溶液混匀后 12000 r/min 离心 10 min，取上清液至新离心管中并加 入 Tris 饱和酚 0.6 mL，混匀后 12000 r/min 离心 10 min。 9.1.1.4 取上清液后至新离心管中并加入三氯甲烷、异戊醇混合溶液（混合比例为 24：1） 0.6 mL， 混匀后 12000 r/min 离心 10 min。 9.1.1.5 取上清液转至新离心管中，并按 1:3 比例加入 95% 乙醇混匀，4 ℃ 静置处理 1 h。 9.1.1.6 12000 r/min 离心 10 min 后保留沉淀并用 75 % 乙醇洗涤 3 次。 9.1.1.7 最后加入 TE 溶液溶解 DNA 于 -20 ℃ 保存。 9.2 PCR 扩增 9.2.1 反应体系 加入模板 DNA 0.2 μL、dNTP 200 μM、引物ITS1（引物序列见附录 B）0.2 μM、引物ITS4（引 物序列见附录 B）0.2 μM、10x PCR 反应缓冲液 1x、Taq酶 2.5 U，用 ddH2O 补足至 25 μL。 9.2.2 9.2.2.1 9.2.2.2 9.2.2.3 9.2.2.4 9.3 反应程序 预变性 94 ℃ 10 min。 变性 94 ℃，30 s，退火 54 ℃，30 s，延伸 72 ℃，45 s，共 35 个循环。 后延伸 72 ℃ 5 min。 保存 4 ℃。 酶切反应 9.3.1 反应体系 加入 PCR 扩增产物 4 μL，限制性内切酶 DraI 0.6 μL，酶切缓冲液 1 μL，用 ddH2O 补足至 10 μL。 9.3.2 酶切条件 3 DB22/T 2988—2019 将样品放置恒温水浴锅或者恒温培养箱，37 ℃培养 4 h ～ 6 h。 9.4 凝胶电泳检测 9.4.1 制胶 9.4.1.1 将煮沸的的琼脂糖凝胶液冷却至 65 ℃ 后缓慢倒入干燥的制胶容器内，使其均匀覆盖在容器 底层，室温冷却至凝固，琼脂糖溶液浓度为 1.0% (用于 DNA 浓度和 PCR 检测) 和 1.8%（用于酶切检测）。 9.4.1.2 凝固后的胶板置于电泳槽内，缓慢、垂直拔出梳子，添加 1×TAE 电泳缓冲液，直至没过胶 板为止。 9.4.2 加样 在点样板上混合样品与上样缓冲液按比例 5︰1 混匀，每加完一个样品均更换移液器的枪头。 9.4.3 电泳 电压在 3 V/cm～5 V/cm 之间，样品由负极向正极移动，当溴酚蓝移动至胶板 2/3 处，停止电泳。 9.4.4 染色 将凝胶转入玻璃或塑料容器中，加入 0.5 ug/mL 核酸染料（EB、goldview 等）中染色 15 min～ 20 min。 9.4.5 成像 将凝胶放置于凝胶成像仪中的紫外灯下观察电泳结果，并拍照记录。 10 试验数据处理 10.1 DNA 片段 白灵菇和杏鲍菇DNA片段大小均为 49 kb±1 kb。 4 DB22/T 2988—2019 10.2 ITS 片段 白灵菇和杏鲍菇的DNA片段大小在均在 660 bp ± 20 bp。 10.3 RFLP 酶切片段 10.3.1 白灵菇酶切后的两条片段大小分别为为 510 bp 和 150 bp。 10.3.2 杏鲍菇酶切后的两条片段大小分别为 430 bp 和 230 bp。 11 鉴定 根据供检菌株的酶切片段大小鉴定，白灵菇酶切后两条片段大小分别为510 bp ± 10 bp、150 bp±10 bp，杏鲍菇酶切后两条片段大小分别为430 bp ± 10 bp、230 ± 10 bp