ICS 65.020.01 B 05 备案号：56323-2017 吉 林 DB22 省 地 方 标 准 DB 22/T 2623.2—2017 黑木耳菌种区别性及真实性鉴定 第 2 部分：酯酶同工酶法 Verification of distinctness and genuineness for Black wood ear spawn Part 2: Esterase isozyme 2017 - 06 - 12 发布 吉林省质量技术监督局 2017 - 08 - 12 实施 发 布 DB22/T 2623.2—2017 前 言 《黑木耳菌种区别性及真实性鉴定》分为以下3个部分： ——DB22/T 2623.1 黑木耳菌种区别性及真实性鉴定 第1部分 对峙培养法 ——DB22/T 2623.2 黑木耳菌种区别性及真实性鉴定 第2部分 酯酶同工酶法 ——DB22/T 2623.3 黑木耳菌种区别性及真实性鉴定 第3部分 SRAP法 本部分为第2部分：酯酶同工酶法。 本标准按照GB/T 1.1—2009和GB/T 20001.4—2015给出的规则起草。 本标准由吉林省农业委员会提出并归口。 本标准起草单位：吉林农业大学、吉林省海外农业投资开发集团有限公司。 本标准主要起草人：姚方杰、张友民、方明、陈影、鲁丽鑫、王鹏、姚允武、于娅、刘宏宇、李丹、 王晓娥、陈艳秋、刘迪、张伟彤、孔祥会、马晓旭、张媛媛、李玉。 I DB22/T 2623.2—2017 黑木耳菌种区别性及真实性鉴定 第 2 部分 酯酶同工酶法 1 范围 本标准规定了黑木耳菌种真实性鉴定酯酶同工酶法的原理、试剂和材料、仪器设备、样品、试验步 骤、试验数据处理。 本标准适用于黑木耳菌种真实性的鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 NY/T 1097 食用菌菌种真实性鉴定 酯酶同工酶电泳法 3 术语和定义 NY/T 1097界定的以及下列术语和定义适用于本文件。为了便于使用，以下重复列出了NY/T 1097 中的术语和定义。 3.1 菌种真实性 genuineness of spawn 供检菌种和对照菌种的符合性。 [NY/T 1097，定义3.1] 4 原理 在生物中，酶的表达受遗传基因的调控。酯酶是多等位基因调控的酶类，在凝胶电泳中经聚丙烯酰 胺凝胶的浓缩，在分子筛效应和电场的电荷效应作用下而发生分离。从食用菌菌丝体中提取的粗酶液经 电泳后，进行酯酶的生物化学染色，不同的酯酶组分显示在凝胶的不同位置而形成酯酶同工酶酶谱。相 同的菌种遗传背景相同，其酯酶同工酶酶谱也相同。因此可以用酯酶同工酶酶谱对黑木耳菌种的真实性 进行鉴定。 5 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 试剂和材料 培养基：见附录 A。 酯酶同工酶上样缓冲液：4×Protein Native PAGE Loading Buffer。 样品提取液（pH 7.5）：见附录 B.1。 过硫酸铵：见附录 B.2。 分离胶缓冲液（pH 8.9）：见附录 B.3。 浓缩胶缓冲液（pH 6.7）：见附录 B.4。 1 DB22/T 2623.2—2017 5.7 5.8 5.9 5.10 5.11 5.12 6 分离胶母液：见附录 B.5。 浓缩胶母液：见附录 B.6。 酯酶同工酶电极缓冲液：见附录 B.7。 磷酸缓冲液：见附录 B.8。 酯酶同工酶电泳染色液：见附录 B.9。 液氮。 仪器设备 6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 7 高速冷冻离心机（10000 rpm 以上）。 全温摇瓶柜：精度±0.1 ℃。 垂直板电泳槽：凝胶面积（W×L）160×180 mm。 稳压稳流电泳仪。 分析天平：感量 0.01 g、0.0001 g 各一台。 样品 7.1 液体培养 直接将接种块接入三角瓶液体培养基中，25 ℃，120 rpm振荡避光培养20 d。培养基的制备参见附 录 A。 7.2 酯酶同工酶样品制备 将振荡培养的黑木耳菌丝球过滤除去水分，获得供检黑木耳供试菌株与标准菌株的菌丝体各3份。 称取菌丝体0.5 g，加液氮研磨，将样品收集于1.5 mL离心管中，加入0.5 mL样品提取液（附录 B.1）。 将研磨后的样品在4 ℃下12000 rpm，离心10 min，取其上清液，将上清液和上样缓冲液按10:1比例混 匀，混合液即为电泳样品。 8 试验步骤 8.1 8.1.1 凝胶制备 分离胶 分离胶浓度9%，按照分离胶缓冲液（附录 B.3）:分离胶母液（附录 B.5）:双蒸水:过硫酸铵（附 录 B.2）=2:5:1:8的比例配制，再加入胶溶液体积0.1%的TEMED，充分混匀。将分离胶灌入胶室至距短 玻璃板上沿2.2 cm～2.5 cm，加入适量的水封住胶面，待凝胶聚合后将水吸出。 8.1.2 浓缩胶 浓缩胶浓度3%，按照浓缩胶缓冲液（附录 B.4）:浓缩胶母液（附录 B.6）:双蒸水:过硫酸铵（附 录 B.2）=1:2:1:4比例混合，再加入胶溶液体积0.1%的TEMED，充分混匀，灌入胶室，立即插入样品梳， 待凝胶。 8.2 2 点样 DB22/T 2623.2—2017 浓缩胶聚合后，小心抽出样品梳，用微量进样器吸去点样孔中多余的水分后，注入电极缓冲液（附 录 B.7），上槽电极缓冲液面要高于短玻璃板，下槽电极缓冲液面要高于铂金丝；用微量进样器吸取15 μL～20 μL样品加入点样孔。 8.3 电泳 将电泳槽放入冰箱内进行低温电泳，采用稳压电泳，电压为130 V，待指示剂进入分离胶后，电压 升至260 V。待前沿指示剂距胶底部约1 cm～1.5 cm，停止电泳。 8.4 取胶染色 倒出电极缓冲液，在水中启开玻璃板，取出凝胶片，浸入染色液（附录 B.9）中，37 ℃染色15 min～ 20 min，用水冲洗干净。 9 9.1 试验数据处理 迁移率 Rf 值计算 应按照NY/T 1097的规定执行。 9.2 判断 将凝胶片用凝胶成像系统拍照存图。对比供检菌株和对照菌株酶带数量与迁移率的大小，若酶带数 量或迁移率不同，用相关软件分析遗传相似系数，相似系数小于1，则供检菌株与对照菌株为不同菌株， 当相似系数等于1则须结合其他鉴定方法判断。 3 DB22/T 2623.2—2017 AA 附 录 A （规范性附录） 培养基制备 200 g新鲜马铃薯，20 g葡萄糖，加去离子水或相当纯度的水补齐至1000 mL，pH自然。100 mL三角 瓶装50 mL左右。 4 DB22/T 2623.2—2017 BB 附 录 B （规范性附录） 试剂的制备 除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂和去离子水或相当纯度的水。 B.1 样品提取液（pH 7.5） 称取6.02 g磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）、0.50 g磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O）溶于水中，定容至100 mL。 B.2 过硫酸铵(1.4 g/L) 称取0.14 g过硫酸铵溶于水中，定容至100 mL，现用现配。 B.3 分离胶缓冲液（pH 8.9） 称取36.3 g三羟甲基氨基甲烷（C4H11NO3，Tris），用48 mL 1 mol/L HCL溶解，TEMED 0.23 mL，定 容至100 mL，4 ℃贮存。 B.4 浓缩胶缓冲液（pH 6.7） 称取5.98 g三羟甲基氨基甲烷（C4H11NO3，Tris），用48 mL 1mol/L HCL溶解，TEMED 0.46 mL，定 容至100 mL，4 ℃贮存。 B.5 分离胶母液 称取28.0 g丙烯酰胺（C3H5NO，Arc）、0.735 g甲叉双丙烯酰胺（C7H10N2O2，Bis），溶于水中，定 容至100 mL，用棕色瓶4 ℃贮存。 B.6 浓缩胶母液 称取10.0 g丙烯酰胺（C3H5NO，Arc）、2.0 g甲叉双丙烯酰胺（C7H10N2O2，Bis）溶于水中，定容至 100 mL，用棕色瓶4 ℃贮存。 B.7 酯酶同工酶电极缓冲液 称取6.0 g三羟甲基氨基甲烷（C4H11NO3，Tris）、28.8 g甘氨酸（C2H5NO2）溶于水中，定容至1 L， 使用时稀释10倍，使用液pH 8.3。 B.8 磷酸缓冲液 5 DB22/T 2623.2—2017 称取22.6 g磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）、21.4 g磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O）溶于水中，定容至1 L。 B.9 酯酶同工酶染色液 称取0.1 g乙酸-1-萘酯、0.1 g乙酸-2-萘酯、0.2 g固兰RR盐，用10 mL丙酮溶解，再加入磷酸缓冲 液300 mL，过滤，现用现配。 _________________________________ 6