ICS 65.020.01 B 05 备案号：56324-2017 吉 林 DB22 省 地 方 标 准 DB 22/T 2623.3—2017 黑木耳菌种区别性及真实性鉴定 第 3 部分：SRAP 法 Verification of distinctness and genuineness for Black wood ear spawn Part 3: SRAP 2017 - 06 - 12 发布 吉林省质量技术监督局 2017 - 08 - 12 实施 发 布 DB22/T 2623.3—2017 前 言 《黑木耳菌种区别性及真实性鉴定》分为以下3个部分： ——DB22/T 2623.1 黑木耳菌种区别性及真实性鉴定 第1部分 对峙培养法 ——DB22/T 2623.2 黑木耳菌种区别性及真实性鉴定 第2部分 酯酶同工酶法 ——DB22/T 2623.3 黑木耳菌种区别性及真实性鉴定 第3部分 SRAP法 本部分为第3部分：SRAP法。 本标准按照GB/T 1.1—2009和GB/T 20001.4—2015给出的规则起草。 本标准由吉林省农业委员会提出并归口。 本标准起草单位：吉林农业大学、吉林省海外农业投资开发集团有限公司。 本标准主要起草人：姚方杰、张友民、方明、陈影、鲁丽鑫、王鹏、姚允武、于娅、刘宏宇、李丹、 王晓娥、陈艳秋、刘迪、张伟彤、孔祥会、马晓旭、张媛媛、李玉。 I DB22/T 2623.3—2017 黑木耳菌种区别性及真实性鉴定 第 3 部分：SRAP 法 1 范围 本标准规定了黑木耳菌种真实性SRAP法的原理、试剂和材料、仪器设备、样品、试验步骤、试验数 据处理。 本标准适用于黑木耳菌种真实性鉴定。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2.1 引物 primer 适用于黑木耳菌株真实性鉴定的一定长度和顺序的寡核苷酸链。 2.2 PCR空白对照 PCR control check 以无菌水作为模板进行PCR反应，以验证PCR反应过程中是否发生污染。 2.3 阴性提取对照 negative control 水作为材料提取DNA，以证明黑木耳DNA在制备过程中是否发生污染。 3 原理 对黑木耳菌种的ORFs区域中内含子、启动子进行特异扩增，检测和比较该序列长度多态性。通过对 PCR产物的检测和比较，识别黑木耳菌种基因组DNA的多态片段，鉴定菌种的真实性。 4 试剂和材料 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 4.8 4.9 4.10 4.11 培养基：见附录 A。 四种脱氧核糖核苷酸(dATP，dCTP，dGTP，dTTP)混合溶液。 TaqDNA 聚合酶。 核酸染料。 DNA 分子量标记。 引物：参见附录 C。 剥离硅烷。 亲和硅烷。 1 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)：见附录 B.1。 0.5 mol/L 乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA-2Na)溶液：见附录 B.2。 CTAB 提取缓冲液：见附录 B.3。 1 DB22/T 2623.3—2017 4.12 4.13 4.14 4.15 4.16 4.17 4.18 4.19 4.20 4.21 4.22 4.23 5 CTAB 纯化缓冲液：见附录 B.4。 氯仿异戊醇（24:1）：见附录 B.5。 酚-氯仿异戊醇（25:24:1）：见附录 B.6。 70%乙醇溶液：见附录 B.7。 30%丙烯酰胺溶液：见附录 B.8。 10%过硫酸铵：见附录 B.9。 8%聚丙烯酰胺凝胶溶液：见附录 B.10。 5×TBE 缓冲液：见附录 B.11。 1×TBE 缓冲液：见附录 B.12。 0.1%硝酸银（AgNO3）溶液：见附录 B.13。 显影液：见附录 B.14。 液氮。 仪器设备 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 6 PCR 扩增仪。 高速冷冻离心机（10000 rpm 以上）。 紫外分光光度计。 全温摇瓶柜：精度±0.1 ℃。 凝胶成像系统。 电热恒温水浴槽：精度±0.1 ℃。 垂直板电泳槽。 稳压稳流电泳仪。 分析天平：感量 0.01 g、0.0001 g 各一台。 样品 6.1 菌丝体培养 直接将接种块接入三角瓶液体培养基中，25 ℃，120 rpm振荡避光培养20 d。培养基的制备参见附 录 A。 6.2 DNA 样品提取 6.2.1 菌丝培养量以可做 3 次平行试验为准，固体方法培养的菌丝，称取 0.2 g 菌丝，液体培养的菌 丝，无菌水冲洗 3 次，用滤纸吸干水分备用，称取菌丝 0.5 g，置研钵中，在液氮中充分研磨成粉末， 迅速转入 1.5 mL 离心管中，加入 650 μL 65 ℃预热的 CTAB（附录 B.3）提取缓冲液。混匀后置于 65 ℃水浴 40 min，轻轻地摇动混匀。 6.2.2 离心管降至室温，加入等体积的酚-氯仿异戊醇（附录 B.6），振荡混匀，4 ℃，12000 rpm 离 心 15 min；将上清液转移至已灭菌的 1.5 mL 离心管中，弃沉淀。 6.2.3 加入等体积的氯仿异戊醇（附录 B.5），4 ℃，12000 rpm 离心 15 min，将上清液转移至已灭 菌的 1.5 mL 离心管中，弃沉淀。 6.2.4 加入 2 倍体积预冷的无水乙醇，静置沉淀 60 min，用无菌枪头挑取白色絮状物至干净离心管中， 无水乙醇充分挥发。 2 DB22/T 2623.3—2017 6.2.5 70%乙醇（附录 B.7）漂洗沉淀，晾干乙醇充分挥发，剩余无色透明状物质黑木耳基因组 DNA。 6.2.6 用 100 μL 的无菌水充分溶解 DNA，加入 2 μL RNAase，37 ℃恒温静置 8 h～12 h。 6.2.7 取出上述静置的 DNA 溶液，用无菌水补足至 300 μL，加入 5 M NaCl 50 μL，CTAB 纯化缓冲 液（附录 B.4）40 μL，65 ℃水浴 10 min。重复 6.2.3、6.2.4、6.2.5 步骤，获得黑木耳基因组 DNA， -20 ℃分装保存备用。不宜反复冻融使用。 6.3 DNA 样品合格性确认 6.3.1 凝胶电泳检测 6.3.1.1 凝胶成像 取5 μL上述溶液与1 μL加样缓冲液混匀，在0.8%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪上或紫外透射仪上 成像。 6.3.1.2 筛选判定 与DNA分子量标记比较，观察所提取的基因组DNA质量及片段大小，按下列标准判定： a) 在点样孔附近呈现一条致密亮带,表明是质量好、分子量大且无降解的 DNA 样品，可用于鉴定； b) 呈现连续分布状态，表明是部分降解的 DNA 样品，不建议用于鉴定； c) 观察不到大片段，表明是严重降解的 DNA 样品，不可用于鉴定。 6.3.2 基因组 A260/A280 的 OD 值检测 无菌水清洗微量核酸检测仪的点样孔三次，并校正对照数值为零。将DNA适当稀释，取1 μL DNA样 品在微量核酸检测仪的点样孔，重复三次读取A260/A280的OD值，依据测得的质量浓度将DNA溶液稀释到 25 ng/μL～50 ng/μL。 7 试验步骤 7.1 PCR 反应 7.1.1 引物 引物见附录 C.1。如果必要可以筛选新的引物。 7.1.2 反应 7.1.2.1 反应体系 PCR反应的总体积为10 μL，含有10×PCR反应缓冲液，150 μmol/L dNTP，1 U Taq聚合酶，引物 2+ 浓度300 pmol/L，50 ng/μL模板DNA，Mg 浓度2.0 mmol/L，其余用灭菌的双蒸馏水补充至10 μL。按 上述比例将反应液依次加入0.2 mL离心管中，混匀，放入PCR仪中，进行PCR扩增。设置PCR空白对照。 7.1.2.2 反应条件 PCR扩增仪上进行以下循环：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，35 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min， 5 个循环；95 ℃变性30 s，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35 个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃ 保存。 7.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 3 DB22/T 2623.3—2017 7.2.1 玻璃板处理 将玻璃板清洗干净，用双蒸水反复冲洗自然晾干，再用无水乙醇擦拭2 遍，吸水纸吸干；在凹板玻 璃上涂上剥离硅烷，长板玻璃上涂上亲和硅烷，涂抹均匀，待玻璃板彻底干燥后进行电泳装置组装，胶 板厚度0.4 mm。 7.2.2 制胶 取100 mL配制好的8%聚丙烯酰胺胶溶液（附录 B.10），加入10%新配制的过硫酸铵（附录 B.9）700 μL和TEMED 65 μL，混匀后，进行灌胶，待胶液充满玻璃板夹层，插入样品梳，注意梳齿下不要产生 气泡，凝胶聚合时间2 h以上。 7.2.3 预电泳 胶聚合后拔出梳齿，用双蒸水冲洗点样孔，冲掉碎胶，将凝胶板安装到电泳槽，夹紧，加入1×TBE 电极缓冲液（附录 B.12），检查设备连接正常后，160 V电压预电泳2 h。 7.2.4 电泳 预电泳结束后，用移液器轻轻吹打胶面，除去气泡和杂质，每个点样孔加样8 µL PCR扩增产物， 加样结束后，以200 V恒压电泳，电泳过程中确保胶板温度不高于50 ℃以免玻璃破裂。待前沿指示剂距 胶底2 cm～3 cm处停止电泳。 7.2.5 银染 电泳结束后，小心取出玻璃板并分开，将凝胶附着的长玻璃板用双蒸水冲洗15 s，重复两次，再转 入0.1% AgNO3溶液（附录 B.13）中，轻轻摇动染色8 min，然后用双蒸水快速漂洗15 s，放入显影液（附 录 B.14）中轻摇至条带清晰可辨为止，最后用双蒸水冲洗2 次。 8 试验数据处理 8.1 结果记录 电泳结束后，将聚丙烯酰胺凝胶置于凝胶成像仪上成像。根据DNA分子量标记判断扩增出的目的条 带的大小，将电泳结果形成电子文件存档或用照相系统拍照。 8.2 PCR 产物质量判断 观察空白对照的凝胶成像照片，按下列结果判断： a) 空白对照为阴性，并且 3 个平行试验结果一致，则本次试验结果可以使用； b) 在阴性提取对照或 PCR 空白对照中扩增出了片段，则说明检测过程中发生了污染，需查找原因 重新检测。 8.3 判定分析 将供检黑木耳菌株PCR扩增的条带与对照菌株比较，若有显著差别，遗传相似系数小于1，可判定供 检菌种与对照菌种为不同菌种；若供检菌种与对照菌种的PCR产物一致，再增加引物个数，进行检测验 证。必要时可以增加其他方法佐证。 4 DB22/T 2623.3—2017 AA 附 录 A （规范性附录） 培养基制备 200 g新鲜马铃薯，20