ICS 67.060 B 22 DB34 安 徽 省 地 方 标 准 DB 34/T 2071—2014 杂交玉米及亲本真实性鉴定 DNA 分析方法 Identification of genuineness of hybrid corn and its parents using DNA analysis method 2014 - 02 - 17 发布 安徽省质量技术监督局 2014 - 03 - 17 实施 发 布 DB34/T 2071—2014 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由安徽省质量技术监督局提出，安徽省农业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：安徽省农业科学院水稻研究所。 本标准主要起草人：陆徐忠、杨剑波、倪金龙、刘勋辉、李莉、汪秀峰、马卉、张小娟。 I DB34/T 2071—2014 杂交玉米及亲本真实性鉴定 DNA 分析方法 1 范围 本标准规定了杂交玉米及亲本品种真实性鉴定SSR分子标记法的术语和定义、原理、试剂与溶液、 主要仪器、操作步骤和结果判定。 本标准适用于玉米单交种和自交系的品种真实性鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 3543.2 农作物种子检验规程 扦样 GB/T 3543.4 农作物种子检验规程 发芽试验 GB 4404.1 粮食作物种子 第1部分:禾谷类 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 品种真实性 varietal genuineness 供检品种与文件记录(如标签等)是否相符。本标准中指品种间在 DNA 分子标记带型上的一致性。 3.2 标准样品 standard sample 经权威机构认定认证的代表已知品种特征特性的样品，对有性繁殖作物而言，一般为种子。 4 原理 根据 SSR 序列两端保守的单拷贝序列设计特异引物，利用 PCR 技术扩增每个位点的重复次数，通 过电泳分析其长度多态性，进行杂交玉米及亲本的真实性鉴定。 5 试剂与溶液 5.1 仅使用分析纯试剂和符合 GB/T 6682 规定的一级水。 5.2 β-巯基乙醇 1 DB34/T 2071—2014 5.3 异丙醇 5.4 剥离硅烷 5.5 四甲基乙二胺（TEMED） 5.6 Taq DNA 聚合酶 5.7 PCR 反应缓冲液（10×Buffer） 5.8 25 mmol/L 氯化镁溶液（MgCl2） 5.9 DNA 分析仪专用丙烯酰胺胶液 5.10 DNA 分析仪专用分子量内标 5.11 DNA 分析仪专用电泳缓冲液 5.12 1 mol/L 三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液（Tris-Hcl）：称取 121.1 g 三羟甲基氨基甲烷（Tris） 溶解于 800 mL 水中，用盐酸（HCl）调 pH 至 8.0，加水定容至 1 000 mL。在 103.4 kPa（121 ℃）条 件下灭菌 20 min，4 ℃储存。 5.13 10 mol/L 氢氧化钠溶液（NaOH）：在 160 mL 水中加入 80.0 g 氢氧化钠（NaOH），溶解后，冷 却至室温，再加水定容到 200 mL。 5.14 0.1 mol/L 氢氧化钠溶液：2 g 固体氢氧化钠溶于 450 mL 水中，加水定容至 500 mL。 5.15 0.5 mol/L 乙二铵四乙酸二钠溶液（EDTA-Na2）（pH 8.0）：称取 187.6 g 乙二铵四乙酸二钠 （EDTA-Na2）加入 800 mL 水中，再加入适量氢氧化钠溶液，加热至完全溶解后，冷却至室温，用氢氧 化钠溶液调 pH 值至 8.0，加水定容至 1000 mL。在 103.4 kPa（121 ℃）条件下灭菌 20 min，4 ℃储存。 5.16 十六烷基三甲基溴化铵提取液（CTAB）：81.7 g 氯化钠和 20 g 十六烷基三甲基溴化铵（CTAB） 溶于 800 mL 水中，然后加入 1 mol/L Tris-HCl 100 mL，0.5 mol/L EDTA-Na2 40 mL，定容至 1000 mL， 4 ℃贮存。 5.17 TE 缓冲液 1：1 mol/l 三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液 5 mL，0.5 mol/l EDTA-Na2 1 mL，加 HCl 调 pH 至 2.0，加水定容至 500 mL。 5.18 TE 缓冲液 2：1 mol/l 三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液 5 mL，0.5 mol/l EDTA-Na2 1 mL，加 HCl 调 pH 至 8.0，加水定容至 500 mL。 5.19 氯仿+异戊醇混合液：体积比为 24+1。 5.20 70％乙醇：量取 70 mL 无水乙醇，加水定容至 100 mL。 5.21 SSR 引物工作液：SSR 标记序列信息参见附录 A。用一级水分别配制终浓度均为 20 μmol/L 的上、 下游引物工作液。 5.22 dNTPs 混合溶液：浓度为 2.5 mmol/L 的 dNTPs 混合溶液。 5.23 5×Tris/硼酸电泳缓冲液（5×TBE）：分别称取 50 g 三羟甲基氨基甲烷、27.5 g 硼酸溶于 500 mL 水中，加入 10 mL 0.5 mol/L EDTA-Na2 溶液，定容至 1000 mL, 4℃储存。 5.24 加样缓冲液：在 98 mL 去离子甲酰胺中加入 250 mg 溴酚蓝（Bromophenol Blue）、250 mg 二甲 苯氰 （Xylene Cyanole FF）、2 mL 0.5 mol/L EDTA-Na2，溶解混匀，常温保存。 5.25 亲和硅烷工作液：在 1 mL 无水乙醇中加入 5 μl 亲和硅烷原液，混匀。 5.26 6％变性聚丙烯酰胺溶液：称取 57 g 丙烯酰胺、3 g 甲叉双丙烯酰胺、420 g 尿素溶于 200 mL 水中，加入 200 mL/L 5×TBE，室温充分溶解后，定容至 1000 mL，4℃储存。丙烯酰胺具神经毒性，配 制时应注意防护。 5.27 10％过硫酸铵溶液：称取 10 g 过硫酸铵溶于 100 mL 水中，4℃储存。 5.28 1％硫代硫酸钠：称取 1 g 硫代硫酸钠，溶于 100 mL 水中，室温储存。 5.29 固定液：在 89.5 mL 水中加入 10 mL 水无水乙醇，0.5 mL 冰醋酸，根据胶板数量调整固定液的 量，现用现配。 5.30 染色液：在 100 mL 水中加入 0.2 g 硝酸银（AgNO3），根据胶板数量调整染色液的量，现用现配。 2 DB34/T 2071—2014 5.31 显影液：在 100 mL 水中加入 1.5 g NaOH 和 0.4 mL 甲醛(37％)，现用现配。 6 主要仪器 6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6 6.7 6.8 6.9 7 PCR 扩增仪。 台式高速冷冻离心机：最大离心力≥10,000 g，温控范围最 -10℃～40℃。 电泳检测系统：垂直电泳系统、毛细管电泳系统。 单道微量移液器：2.5 μL、10 μL、20 μL、100 μL、200 μL、1000 μL。 多道微量移液器：8 道或 12 道，10 μL、100 μL、300 μL。 酸度计：精度 ±0.01 pH。 电子天平：可读性为百分之一、万分之一。 胶片观察灯。 脱色摇床。 操作步骤 7.1 试样制备 以受检样品所标注品种的标准样品作为对照，同时检测受检样品和标准样品。受检样品和标准样品 可为棉花的种子、幼嫩叶片等。 样品纯度应符合 GB 4404.1 的规定，种子扦样按 GB/T 3543.2 规定执行，种子发芽按 GB/T 3543.4 规定执行（幼苗长度达 3 cm 左右用于制备 PCR 模板）。 7.2 PCR 模板制备 分别从受检样品和标准样品中随机抽取 5 粒种子或单株，根据实际情况从以下两种方法中选择任 一方法制备模板 DNA。 7.2.1 碱裂解法 幼苗或幼嫩叶片，每株取 1.5 cm 长，剪碎；干种子直接剥取胚。将样品按单株分别放入 96 孔板 中，每孔加入 100 μL 氢氧化钠提取液及 1 μL β-巯基乙醇，沸水加热5 min，然后每孔再分别加入 100 μL TE 缓冲液 1，直接取 2 μL 作为模板进行 PCR 扩增。 7.2.2 CTAB 法 取幼苗或幼嫩叶片约 200～300 mg，置于 2.0 mL 离心管，加液氮充分研磨，或取种子充分磨碎， 移入 2.0 mL 离心管；每管加入 700 µL 65℃预热的 CTAB 提取液后，充分混合，65℃保温 60 min， 期间多次颠倒混匀；每管加入等体积的三氯甲烷+异戊醇混合液，充分混合后，静置 10 min；12,000 rpm 离心 15 min 后，吸取上清液至一新离心管，再加入等体积预冷的异丙醇，颠倒离心管数次，在 -20 ℃放置 30 min； 4℃，12,000 rpm 离心 10 min，弃上清；加入 70％乙醇，旋转离心管数次，弃去乙 醇；将离心管倒立于垫有滤纸的试验台上，室温干燥沉淀 6 h 以上；加入 100 µL 超纯水或 TE 缓冲 液 2，充分溶解后备用。 7.3 PCR 扩增 利用 40 对核心引物（见附录 A）对受检样品和标准样品 DNA 进行扩增。 3 DB34/T 2071—2014 7.3.1 PCR 扩增反应体系 在PCR反应管中按表1 依次加入反应试剂，混匀。 表1 PCR 扩增反应体系 反应组分 原浓度 终浓度 推荐反应体积（20L） 10×缓冲液 10× 1× 2.0 MgCl2 25 mmol/L 2.5 mmol/L 2.0 dNTPs 2.5 mmol/L 每种 0.15 mmol/L 每种 1.2 Tag酶 5.0 U/L 1.0 U 0.2 引物 20 mol/L 每种 0.25 mol/L 每种 0.25 PCR模板 －* －* 2.0 一级水 －* －* 12.35 注：“*”表示体积不确定。如果 PCR 缓冲液中含有氯化镁，则不加氯化镁溶液；根据 Taq 酶的浓度确定其体积，并 相应调整水的体积，使反应体系总体积达到20.0 µL。 7.3.2 PCR 扩增反应程序 94℃预变性 5 min；94℃变性 40 s，60℃退火 35 s，72℃延伸 45 s，循环 35 次后；72℃延伸 10 min，4℃保存。 7.4 PCR 产物的电泳检测 PCR 产