ICS 35.240.80 C 07 团体标准 T/CHIA 21.4-2021 组学样本处理与数据分析标准 第4部分：转录组文库构建 Specification of omics sample processing and data analysis Part 4:transcriptome library construction 2021-07-11发布 2021-08-01实施 中国卫生信息与健康医疗大数据学会 发布 全国团体标准信息平台 T/CHIA 21.4-2021 I 目 次 前言 ................................ ................................ ................................ ................................ .................. II 引言 ................................ ................................ ................................ ................................ ................. III 1 范围 ................................ ................................ ................................ ................................ ............... 1 2 规范性引用文件 ................................ ................................ ................................ ........................... 1 3 术语和定义 ................................ ................................ ................................ ................................ ... 1 4 多细胞转录组文库构建 ................................ ................................ ................................ ............... 1 5 单细胞转录组文库构建 ................................ ................................ ................................ ............... 4 参考文献 ................................ ................................ ................................ ................................ ........... 7 全国团体标准信息平台 T/CHIA 21.4-2021 II 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 -2020给出的规则起草。 T/CHIA 21《组学样本处理与数据分析标准》 分为以下五部分： ――第1部分：全基因组测序数据分析； ――第2部分：全外显子组测序数据分析； ――第3部分：转录组样本处理； ――第4部分：转录组文库构建； ――第5部分：转录组测序数据分析。 本文件为T/CHIA 21的第4部分。 本文件由中国科学院北京基因组研究所（国家生物信息中心） 提出，由中国卫生信息与 健康大数据学会归口 。 本文件起草单位： 中国科学院北京基因组研究所（国家生物信息中心）、中国科学院生 物物理研究所、 浙江大学、复旦大学、清华大学、中国人民解放军总医院、 北京蛋白质组研 究中心、 中国科学院微生物研究所、 北京大学人民医院、 中国科学院上海营养与健康研究所、 中南大学、 空军军医大学（第四军医大学）。 本文件主要起草人： 方向东、 陈润生、金力、何昆仑、李亦学、张学工、 何顺民、段会 龙、周水庚、渠鸿竹、辛子娟、王晨、王霞、吕旭东、朱云平、 马俊才、杨忠、石乐明、 吴 松峰、吴林寰、王振、陈先来、吴珏 、张昭军、娄晓敏、阮修艳、单广乐 。 全国团体标准信息平台 T/CHIA 21.4-2021 III 引 言 《组学样本处理与数据分析 标准 第4部分：转录组文库构建 》为生命科学领域样品 RNA 提取之后的文库构建提供一套术语及操作规范。防止术语不规范等问题。 测序技术的不断发展，使我们能够对转录组开展更为深入的测序工作，能够发现更多、 更新、 更可靠的转录组信息， 测序平台更新迅速， 要求我们须及时更新转录组文库构建方法， 以便满足 测序平台的升级换代。本 文件为转录组文库构建提供统一标准。 全国团体标准信息平台 T/CHIA 21.4-2021 1 组学样本处理与数据分析标准 第4部分：转录组文库构建 1 范围 本标准规定了转录组样本文库构建操作流程 。 本标准适用于转录组样本的文库构建。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本 适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件， 其最新版本 （包括所有的修改单） 适用于本文件。 GB/T 30989 —2014 高通量基因测序技术规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准 3.1 转录组 transcriptome 转录组是指 编码蛋白质的mRNA及非编码 RNA的所有 RNA分子的集合，包括 rRNA、 tRNA、lncRNA、pri-miRNA等。 3.2 cDNA文库 cDNA library 将处于特定发育阶段真核生物体的特定器官或组织中提取的总 RNA, 经过反转录等一 系列的生化反应合成双链 cDNA 群体后 , 再插入到适当的载体上 , 经转化寄主菌株构成的 特定 cDNA 克隆群体。 [GB/T 30989 —2014，定义 3.5] 3.3 细胞标签 cell barcode 细胞标签是基于标签 （ barcode） 来进行单细胞区分与识别的一项技术。 它的主要思想是， 给每个细胞加上独一无二的 DNA序列，这样在测序的时候，就把携带相同 barcode的序列视 为来自同一个细胞了。通过这种策略，可以一次建库测得数百上千个单细胞的信息。 3.4 UMI unique molecular identifier UMIs是由 4-10个随机核苷酸组成的序列，转录组建库 时在mRNA反转后引入到文库中， 每一个 RNA会随机连上一个 UMI， 因此可以通过计数不同的 UMI来最终计算出 mRNA的数量， 避开了建库中 PCR扩增引入的重复问题。 4 多细胞转录组文库构建 生物体中总 RNA=（～ 90%）rRNA+（1～2%）mRNA+（8～9%）其他 RNA。对于真核 生物，可通过 oligo dT 磁珠富集 mRNA来进行建库，而如果想研究 lncRNA或原核生物转 录组，可以通过去除 rRNA的方法进行建库。 全国团体标准信息平台 T/CHIA 21.4-2021 2 4.1 普通转录组建库 4.1.1 总RNA提取 RNA提取步骤见 《组学样本处理与数据分析标准 第3部分：转录组样本 处理》，提取 后的总 RNA要进行纯度 （purity）、 浓度（quantity）、 完整性（ RIN，RNA integrity number ） 的质量检查。 4.1.2 mRNA分离 PolyA 富集（可以用 PolyA Purist™ MAG Kit ，货号 Invitrogen™ AM1922 ，该试剂盒约 能洗提下来 总RNA中1%的mRNA）成熟 mRNA提取的具体实验操作如下： 1) 用nuclear free （NF）水将样品稀释成 600 μ g/mL，即600 ng/μL；记录此时样本体 积，为a μL； 2) 加等体积即 a μL的2X binding solution ； 3) 取等质量的 oligo（dt）磁珠（10 mg/m L），即