ICS 65.020.30 CCS B 41 13 河 北 省 地 方 标 准 DB 13/T 5573—2022 鸡粪肠球菌病综合诊断技术规程 2022 - 05 - 31 发布 2022 - 07 - 01 实施 河北省市场监督管理局 发 布 DB 13/T 5573—2022 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规 定起草。 本文件由河北省农业农村厅提出。 本文件起草单位：河北工程大学、河北征宇制药有限公司。 本文件主要起草人：柳焕章、刘建钗、张鹤平、刘利强、刘会洽、闫金坤、崔国林、王宏艳、刘 彦威、刘娜、王春霞、程龙、刘学彬、李晶晶、娄路平、李夫宏。 I DB 13/T 5573—2022 鸡粪肠球菌病综合诊断技术规程 1 范围 本文件规定了鸡粪肠球菌病临床诊断、实验室诊断和综合判定等技术要求。 本文件适用于鸡、鸭、鹅、鸽子、鹌鹑等粪肠球菌病诊断。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本 文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 16548 病害动物和病害动物产品生物安全处理规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 粪肠球菌 Enterococcus faecalis 为革兰氏阳性，过氧化氢阴性球菌。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 BEAA：叠氮钠-结晶紫-七叶苷培养基； PCR：聚合酶链式反应； H-E染色：苏木精-伊红染色； TSA：胰蛋白胨大豆琼脂培养基；TSB：胰蛋白胨大豆液体培养基； SDS：十二烷基磺酸钠； EDTA：乙二胺四乙酸。 5 临床诊断 当禽出现以下部分或全部情形时，可作为初步诊断的依据。 临床症状 各日龄禽均可感染，雏禽易感，呈眼神呆滞、眯眼、脐炎、呼吸困难等症状；青年禽呈轻微腹泻 症状；成年禽出现产蛋量下降症状、种蛋孵化率明显降低，死胚明显。 剖检病变 死胚皮下有胶冻样物质，肝脏呈土黄色；病雏卵黄吸收不全，肝脏发生不同程度坏死、淤血或 出血，肺出血。成年禽病变不明显。 6 实验室诊断 采用荧光定量PCR检测技术，结合临床症状确诊。 荧光定量 PCR 检测 6.1.1 样品采集 1 DB 13/T 5573—2022 选择临床有症状的病禽，采集肝肺等病变组织1 g，放入1.5 mL灭菌EP管中，编号， -20 ℃保存 备用。 6.1.2 基因组 DNA 提取 取组织样本0.2 g放入组织研磨器中研磨，收集样本0.05 g～0.1 g于1.5mL EP管中，加入500 μL 裂解液（400 mM Tris-HCl [pH 8.0]，60 mM EDTA） [pH 8.0]，150 mM NaCl，1% SDS），室温放置 10 min；加150μL乙酸钾（pH 4.8），漩涡震荡，12000 g离心1 min，取上清液放入新试管，加入等体 积异丙醇；DNA团块用70%乙醇清洗，干燥后溶解在50 μL TE（10 mM Tris，1 mM EDTA）中保存。或者 使用DNA提取试剂盒提取。 6.1.3 引物合成 参照GenBank中粪肠球菌sodA 基因，使用Primer Express 5.0软件设计粪肠球菌特异性引物（预 期扩增片段大小360bp）： 上游引物F：5ʹ-ACTTATGTGACTAACTTAACC-3ʹ 下游引物R：5ʹ-TAATGGTGAATCTTGGTTTGG-3ʹ 6.1.4 荧光定量 PCR 反应体系和反应程序 采用25μL的反应体系：SYBR Premix Ex Taq（2×）12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，DNA模板1.0 μL，用双蒸水补足至25 μL。反应程序为：93 ℃预变性5 min；93 ℃ 15 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s， 进行40个循环，72 ℃延伸7 min，于4 ℃终止反应。 6.1.5 荧光 PCR 结果判断 当待测样品实时荧光定量PCR检测结果有“S”型扩增曲线，Ct值≤36.5，且Tm值为86 ℃时，判定待 测样品中含有鸡粪肠球菌，而且可通过Ct值大小判断感染的程度（参见附录A）。 综合判定 结合临床症状、病理变化和荧光定量PCR检测结果，可确诊鸡粪肠球菌病。 7 剖检尸体和污染物处理 病害鸡只及其产品的生物安全处理应符合GB 16548的规定。 2 DB 13/T 5573—2022 A A 附 录 A （资料性） 感染程度推断 A.1 感染程度推断 8 1 定量PCR标准曲线的建立是在线性范围内以各浓度（10 ～10 ）的对数为横坐标，以其对应的Ct 2 值为纵坐标，用Excel制作标准曲线，得到回归方程 y = -2.44 x + 30.53，决定系数 R = 0.9983。 因此，可通过临床样品检测的Ct值计算出其所含病原体的浓度和数量，从而推断感染的程度。 3