ICS 65.020.20 CCS B 05 13 河 北 省 地 方 标 准 DB 13/T 5583—2022 噬菌体防控奶牛乳房炎技术规程 2022 - 05 - 31 发布 2022 - 07 - 01 实施 河北省市场监督管理局 发 布 DB 13/T 5583—2022 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规 定起草。 本文件由河北省农业农村厅提出。 本文件起草单位：河北工程大学、中国农业大学、河北乐源牧业有限公司。 本文件主要起草人：石玉祥、韩博、高健、钟翠红、侯新峰、王皓婷、朱阵、支龙彬、刘江涛、 靳爱红、张晓云、郜霞、崔玉革、张欢。 I DB 13/T 5583—2022 噬菌体防控奶牛乳房炎技术规程 1 范围 本文件规定了噬菌体防控奶牛乳房炎的病原菌分离鉴定、噬菌体悬浮液的制备、防控措施等技 术要求。 本文件适用于由无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和肺炎克雷伯杆菌等细菌性奶牛乳房 炎的噬菌体预防和治疗。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用 文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单） 适用于本文件。 GB/T 14926.13 实验动物 肺炎克雷伯杆菌检测方法 GB/T 16586 奶牛场卫生规范 NY/T 541 动物疫病实验室检验采样方法 NY/T 555 动物产品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌的检测方法 NY/T 1948 兽医实验室生物安全要求通则 NY/T 2962 奶牛乳房炎乳汁中金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、无乳链球菌分离鉴定 方法 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 病原菌的分离鉴定 参照NY/T 541采集样品后，按照NY/T 2962分离鉴定金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、无 乳链球菌；按照GB/T 14926.13分离鉴定肺炎克雷伯杆菌；按照NY/T 555分离鉴定大肠杆菌；按传统 方法分离鉴定其它乳房炎源性病原菌。 5 噬菌体混悬液的制备 污水采集与处理。从奶牛养殖场污水管道采集污水样品，8000 r/min 离心 15 min，取上清液， 弃沉淀，经 0.22 μm 微孔滤器过滤，滤液备用。 噬菌体的分离纯化。将鉴定的病原菌作为诱导菌，利用双层琼脂平板法培养噬菌体，挑选大小 一致噬菌斑，再利用双层琼脂平板法纯化培养噬菌体。吸取噬菌体纯化液，加至电镜专用铜网上， 用 2%醋酸铀染色，干燥，通过透射电子显微镜观察噬菌体超微结构。再利用双层琼脂平板法对具有 典型形态特征的噬菌体进行纯化。 宽谱噬菌体的筛选。将鉴定的病原菌菌液接种于双层平板，静置，再取噬菌体悬液滴于双层琼 脂平板上，倒置于 37 ℃恒温箱中，过夜培养，观察双层琼脂平板是否形成噬菌斑，根据噬菌体吞噬 不同种类病原菌菌株的数量筛选宽谱噬菌体。 噬菌体混悬液的制备。将 0.5 mL 病原菌噬菌体混悬液加到 3 mL LB 液体培养基后，分别加入 100 μL 同种病原菌菌液，37 ℃ 220 r/min 条件下，置于摇床震荡培养 16 h。4 ℃条件下 8000 r/min 4 离心 10 min， 将沉淀再用无菌水悬浮； 再用 0.22 μm 滤膜过滤悬液。 滤液（噬菌体浓度≥1×10 PFU/mL） 4 ℃保存。 噬菌体混悬液污染状况检测。取噬菌体混悬液，均匀涂布于普通营养琼脂平板培养基，37 ℃倒 置培养 24 h，观察培养平板有无菌落生长。若有细菌菌落生长，应重新过滤或制备噬菌体混悬液。 1 DB 13/T 5583—2022 6 防控 6.1.1 环境病原菌的净化。牛舍、运动场空间宽敞，保持阳光充足；保持牛床清洁、干燥，垫料干、 软、清洁、新鲜，奶牛场卫生符合 GB/T 16586 规定；根据奶牛乳房炎源性病原菌的分离鉴定种类制 备噬菌体混悬液，按 1%比例向新制备病原菌噬菌体混悬液加水，混匀，用稀释液喷洒奶牛舍的卧床、 运动场及料槽，每周 1 次。 6.1.2 奶牛乳头病原菌的净化。挤奶完毕，用温水清洗奶牛的乳房后，将其乳头完全浸于盛有 60% 碘液药浴杯中 5～10 秒；乳头药浴风干，再将乳头浸于盛有新制备噬菌体混悬液药浴杯中 5～10 秒。 6.1.3 饲养管理。根据营养需要配制奶牛各生产阶段精、粗饲料，增加奶牛青绿、青贮料的饲喂量。 干奶后期，增加奶牛精料、维生素 E、硒的饲喂量，控制盐和多汁饲料的饲喂量。减少环境冷、热及 挤奶应激，增加奶牛的运动量。 7 治疗 消除病原。参照 6.1.2 用碘液对奶牛乳头消毒；再用噬菌体混悬液浸浴。严重病例，可同时配 合药物治疗。 辅助治疗。加强饲养管理，做好乳房卫生，提高奶牛抗病力；同时参照 6.1.1 用消毒液、噬菌 体混悬液喷洒奶牛舍和运动场。 8 生物安全 实验室操作参照NY/T 1948兽医实验室生物安全要求通则。 2