ICS 65.020.01 CCS B05 15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 2540—2022 羊肚菌菌种制作技术规程 Regulation of strain manufacture for morehella esculenta 2022-04-25 发布 2022-05-25 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发 布 DB15/T 2540—2022 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由内蒙古自治区果蔬标准化技术委员会（SAM/TC 25）归口。 本文件起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院、赤峰市克什克腾旗农牧局、内蒙古瑞福杨种植 专业合作社。 本文件主要起草人：于传宗、孙国琴、王海燕、庞杰、李亚娇、慕宗杰、于凤玲、刘瑞、田永 雷、韩凤英、云伏雨、田文龙。 I DB15/T 2540—2022 羊肚菌菌种制作技术规程 1 范围 本文件规定了羊肚菌菌种生产技术要求。 本文件适用于羊肚菌母种、原种和栽培种菌种生产技术。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB 4806.7 食品安全国家标准 食品接触用塑料材料及制品 NY/T 528 食用菌菌种生产技术规程 NY/T 1731 食用菌菌种良好作业规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 羊肚菌 morehella esculenta 真菌学分类属盘菌目，羊肚菌科，羊肚菌属。羊肚菌由羊肚状的可孕头状体菌盖和一个不孕的菌柄 组成。表面形成许多凹坑，似羊肚状，淡黄褐色，柄白色，菌盖表面有网状棱的子实层，边缘与菌柄相 连。菌柄圆筒状、中空，表面平滑或有凹槽。 菌种 spawn 通过生产试验验证具有特异性、均一性和稳定性，丰产性好、抗性强的菌株或品种，生长在适宜基 质上具结实性的菌丝培养物，包括母种、原种和栽培种。 母种 stock culture 经各种方法选育得到的具有结实性的菌丝体纯培养物及其继代培养物。也称为一级种、试管种。 原种 pre-culture spawn 1 DB15/T 2540—2022 由母种移植、扩大培养而成的菌丝体纯培养物。常以菌种瓶（玻璃菌种瓶或塑料菌种瓶）或（12～ 17）cm×（22～28）cm×（0.04～0.05）mm聚丙烯塑料袋为容器。也称为二级种。 栽培种 spawn 由原种移植、扩大培养而成的菌丝体纯培养物。常以菌种瓶（玻璃瓶或塑料瓶）或（15～17）cm× （33～35）cm×（0.04～0.05）mm聚丙烯塑料袋为容器。栽培种只能用于扩大到栽培出菇袋或直接出菇， 不可以再次扩大繁殖菌种。也称为三级种。 4 菌种生产要求 人员 生产所需要的技术人员和检验人员经过专业培训、掌握基础知识及菌种生产技术规程要求的相应 专业技术人员。 场地、厂房要求 菌种生产应选择地势高，通风良好，空气清新，水源近，排水通畅，交通便利的场所。 菌种生产厂房要求有各自隔离的摊晒场、原材料库、配料分装库。配套有配料室、搅拌室、装袋（瓶） 室、灭菌室、冷却室、接种室、培养室（通风好，有纱窗）、菌种检测室及菌种冷藏库等各环节的设施。 冷却室、接种室，培养室都要有离子净化设施。 生产设备 菌种生产需要粉碎机、电子秤、搅拌机、装袋（瓶）机、高压灭菌锅或常压灭菌锅、离子净化器、 超净工作台或接种箱、恒温培养箱、培养架、摇床、液体菌种灌（30 L～600 L）、显微镜等设备。符 合NY/T 528规定。 5 母种生产 培养基 马玲薯200 g(煮汁)，葡萄糖20 g，琼脂20 g，蛋白胨0.5 g，牛肉膏0.5 g，水1000 ml。 容器 试管选用18 mm×180 mm或者20 mm×200 mm；培养皿选用直径7 cm～9 cm 玻璃培养皿或一次性塑 料培养皿。 分装和灭菌 5.3.1 斜面培养基分装和灭菌 分装培养基至试管1/4处，用棉塞或硅胶塞封闭试管口，每5支试管为1把，牛皮纸包棉塞，橡皮筋 扎紧，棉塞向上放置。棉塞应采用梳棉，不能使用脱脂棉。121 ℃～122 ℃（0.11 MPa～0.12 MPa）恒 温灭菌25 min。 2 DB15/T 2540—2022 降温至（65±5）℃ 时取出试管，在空气清洁的室内摆斜面，要求斜面长度不超过试管长度的2/3， 自然降温凝固后成斜面。从摆好的试管中抽取3 %～5 %的试管，在28 ℃下培养48 h，无微生物长出为 灭菌合格。 5.3.2 平板培养基分装和灭菌 培养基装入300 ml～500 ml三角瓶至刻度的2/3处，用带滤膜的封口膜封口后放入灭菌锅；玻璃培 养皿用报纸包好，放入灭菌锅。在温度升至 102 ℃～105 ℃ 排净冷空气后升压，升至121 ℃～122 ℃ （0.11 MPa～0.12 MPa） 恒温灭菌25 min。 降温至（65±5）℃ 时，在超净工作台内将三角瓶中的培养基分装至无菌培养皿中，培养基占培养 皿高度的1/3～1/2。 接种 在超净工作台或接种箱内接种，接种前用紫外灭菌灯照射30 min，之后用75 %酒精进行表面消毒。 接菌过程严格执行无菌操作，接种后及时贴好标签并做好记录。 接种的菌块3 mm～5 mm，接种在培养皿或试管的中部。培养皿需用石腊封口膜密封。 菌丝长满试管斜面或培养皿表面即可使用。 培养 温度控制在18 ℃～26 ℃，空气湿度在75 %以下，通风避光培养。 接种后第3 d、第5 d和长满培养基后分别进行检验，挑出未活、污染和生长不良的不合格培养器皿。 检查方式符合NY/T 1731规定。 6 原种、栽培种生产 培养基 以下培养基配方任选其一： a) 柠条粉 72 %、麦麸 25 %、石膏 1.5 %、过磷酸钙 1.5 %； b) 玉米芯 53 %、柠条粉 30 %、米糖 15 %、石膏 1 %、过磷酸钙 1 %； c) 谷粒或麦粒或玉米粒 90 %、柠条粉或棉籽壳或木屑或玉米芯粉或豆秸粉 9 %、石膏 1 %。 容器 原种采用 850 ml 以下、瓶口直径小于等于 4 cm、耐 126 ℃ 高温的透明瓶子或菌种瓶，也可以采 用（12～17）cm×（22～28）cm×（0.04～0.05）mm 的聚丙烯塑料袋。 栽培种采用同原种要求相同的瓶子，也可采用（15～17）cm×（33～35）cm×（0.04～0.05）mm 的 聚丙烯塑料袋。 以上聚丙烯塑料袋均符合GB 4806.7要求。 装袋（瓶） 采用装袋（瓶）机或人工进行装袋（瓶），人工装袋（瓶）需用打孔器在袋口处打孔，孔直径1 cm～ 1.5 cm 深度为8 cm～12 cm，每袋（瓶）装培养基质500 g～600 g，塑料袋用无棉盖体套环封口或窝口 海绵塞封口。 3 DB15/T 2540—2022 灭菌 可采用高压灭菌和常压灭菌。 高压灭菌： 组合培养料在121 ℃～122 ℃（0.11 MPa～0.12 MPa）下灭菌2 h；粮食培养基在 121 ℃～ 122 ℃（0.11 MPa～0.12 MPa）下灭菌 2.5 h。 常压灭菌：在3 h之内使温度升至100 ℃，恒温保持10 h～12 h。 接种 高压灭菌：组合培养料在121 ℃～122 ℃（0.11 MPa～0.12 MPa）下灭菌2 h；粮食培养基在121 ℃～ 122 ℃（0.11 MPa～0.12 MPa）下灭菌2.5 h。 常压灭菌：在3 h之内使温度升至100 ℃，恒温保持10 h～12 h。 培养 通风避光、21 ℃～26 ℃下培养。 贮存 原种和栽培种在0 ℃～4 ℃下贮存，贮存期不超过50 d。 7 检验 母种感官要求见表 1。 表1 羊肚菌母种感官要求 项目 要求 容器 完整、无损、洁净 棉塞或无棉盖体 干燥、整洁、松紧适度、能满足透气和过滤要求 培养基灌入量 为试管总容积的 1/4，培养皿高的的 1/3～1/2 菌丝生长量 长满斜面或平板 菌 菌丝体特征 菌丝洁白、绒毛状、生长致密、均匀、健壮 种 菌丝体表面 均匀、舒展、平整 外 菌丝体分泌物 无 观 菌落边缘 整齐 杂菌菌落 无 斜面背面外观 4 培养基不干缩，无积水、颜色均匀、无暗斑、无色素 DB15/T 2540—2022 原种感官要求见表 2。 表2 羊肚菌原种感官要求 项目 要求 容器 完整、无破损、洁净 棉塞或无棉盖体 干燥、整洁、松紧适度、能满足透气和滤菌要求 培养基上表面距瓶（袋） 口的距离 菌 种 外 观 （50±5） mm 菌丝生长量 长满容器 菌丝体特征 菌丝体白、生长旺健、整齐 培养物表面菌丝体 生长均匀、无高温抑制线 培养基及菌丝体 紧贴瓶壁、无干缩 菌丝分泌物 无、允许少量无色至棕黄色水珠 杂菌菌落 无 子实体原基 无 栽培种感官要求见表 3。 表3 羊肚菌栽培种感官要求 项目 要求 容器 完整、无破损 棉塞或无棉盖体 干燥、整洁、松紧适度、能满足透气和滤菌要求 培养基上表面距瓶（袋） 口的距离 （50±5） mm 菌丝生长量 长满容器 菌 菌丝体特征 生长均匀、色泽一致、无角变、无高温抑制线 种 培养基及菌丝体 紧贴瓶壁、无干缩 外 菌丝分泌物 无 观 杂菌菌落 无 子实体原基 允许少量、出现原基种类小于等于5% 8 入库 检验完成后及时入菌种库，详细记录各生产环节，菌种库温度0 ℃～4 ℃，避光，适当通风，定期 对空间进行杀菌处理。 5