ICS 65.020.01 CCS B05 15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 2544—2022 大球盖菇菌种制作技术规程 Regulation of strain manufacture for stropharia rugosoannulata 2022-04-25 发布 2022-05-25 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发 布 DB15/T 2544—2022 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由内蒙古自治区果蔬标准化技术委员会（SAM/TC 25）归口。 本文件起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院。 本文件主要起草人：王海燕、孙国琴、李亚娇、庞杰、于传宗、王永、韩凤英、扈顺、薛国萍、 慕宗杰、付崇毅、康立茹。 I DB15/T 2544—2022 大球盖菇菌种制作技术规程 1 范围 本文件规定了大球盖菇菌种生产要求、母种生产、原种和栽培种生产、检验、入库等技术流程要点。 本文件适用于大球盖菇母种、原种、栽培种菌种制作要求。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB 4806.7 食品安全国家标准食品接触用塑料材料及制品 NY/T 528 食用菌菌种生产技术规程 NY/T 1731 食用菌菌种良好作业规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 菌种 spawn 通过生产试验验证具有特异性、均一性和稳定性，丰产性好、抗性强的大球盖菇菌株或品种，培养 生长在适宜基质上具结实性的菌丝培养物，包括母种、原种和栽培种。 母种 stock culture 经各种方法选育得到的具有结实性的菌丝体纯培养物及其继代培养物，以玻璃试管或培养皿为培 养容器和使用单位，也称为一级种、试管种。 原种 pre-culture spawn 由母种移植、扩大培养而成的菌丝体纯培养物。常以菌种瓶（玻璃菌种瓶或塑料菌种瓶）或（12～ 17）cm×（22～28）cm×（0.04～0.05）mm聚丙烯塑料袋为容器。也称为二级种。 栽培种 spawn 1 DB15/T 2544—2022 由原种移植、扩大培养而成的菌丝体纯培养物。常以菌种瓶（玻璃瓶或塑料瓶）或（15～17）cm× （33～35） cm×（0.04～0.05） mm聚丙烯塑料袋为容器。栽培种只能用于扩大到栽培出菇袋或直接出 菇，不可以再次扩大繁殖菌种。也称为三级种。 4 菌种生产要求 人员 生产所需要的技术人员和检验人员应经过专业培训、掌握基础知识及菌种生产技术规程要求的相 应专业技术人员。 场地、厂房 菌种生产应选择地势高，通风良好，空气清新，水源近，排水通畅，交通便利的场所。场地环境 条件符合NY/T 528规定。 菌种生产厂房要求有各自隔离的摊晒场、原材料库、配料分装库。配套有配料室、搅拌室、装袋（瓶） 室、灭菌室、冷却室、接种室、培养室（通风好，有纱窗）、菌种检测室及菌种冷藏库等各环节的设施。 冷却室、接种室，培养室都要有离子净化设施。菌种生产厂房条件应符合NY/T 1731规定。 生产设备 菌种生产需要粉碎机、电子秤、搅拌机、装袋（瓶）机、高压灭菌锅或常压灭菌锅、离子净化器、 超净工作台或接种箱、恒温培养箱、培养架、摇床、液体菌种灌（30 L～250 L）、显微镜等设备。菌 种生产设备应符合NY/T 1731规定。 5 母种生产 培养基 马铃薯200 g、葡萄糖20 g、蛋白胨1.5 g、琼脂18 g、加水至1000 mL。 容器 试管规格18 mm×180 mm或者20 mm×200 mm；培养皿直径7 cm～9 cm；三角瓶规格300 mL～500 mL。 分装和灭菌 5.3.1 斜面培养基分装和灭菌 分装培养基至试管1/4处，用棉塞或硅胶塞封闭试管口，每5支试管为1把，牛皮纸包棉塞，橡皮筋 扎紧，棉塞向上放置。棉塞应采用梳棉，不能使用脱脂棉。在121 ℃～122 ℃（0.11 MPa～0.12 MPa） 下灭菌25 min。 灭菌后温度降到（65±5）℃时，在空气清洁的室内摆斜面，要求斜面长度不超过试管长度的2/3。 从摆好的试管中抽取3 %～5 %的试管，在28 ℃下培养48 h，无微生物长出为灭菌合格。 5.3.2 平板培养基分装和灭菌 2 DB15/T 2544—2022 培养基装入300 mL～500 mL三角瓶至刻度的2/3处，用带滤膜的封口膜封口后放入灭菌锅；玻璃培 养皿用报纸包好，放入灭菌锅。在温度升至102 ℃～105 ℃排净冷空气后升压，升至121 ℃～122 ℃ （0.11 MPa～0.12 MPa）恒温灭菌25 min。 灭菌后温度降到（65±5）℃时，在超净工作台内将三角瓶中的培养基分装至无菌培养皿中，培养 基占培养皿高度的1/3～1/2。 接种 超净工作台或接种箱紫外灯照射30 min后吹风，之后用75 %酒精进行表面消毒。接菌过程严格执行 无菌操作，接种后及时贴好标签并做好记录。 将3 mm～5 mm菌块接种在培养皿或试管培养基的中部，培养皿需用石腊封口膜密封。 菌丝长满培养基表面即可使用。 培养 在通风避光、18 ℃～28 ℃下培养。 接种后每隔2 d～3 d检验一次，挑出菌种未活、污染和生长不良的不合格培养物。 6 原种、栽培种生产 培养基 谷粒或麦粒90 %，柠条粉、麦麸、棉籽壳、玉米芯粉或豆秸粉9 %，石膏1 %。水分含量60 %～65 %， pH值调至6～7。 容器 原种采用850 ml以下、瓶口直径小于等于4 cm、耐126 ℃高温的菌种瓶，也可以采用（12～17） cm×（22～28）cm×（0.04～0.05）mm的聚丙烯塑料袋。 栽培种采用同原种要求相同的瓶子，也可采用（15～17）cm×（33～35）cm×（0.04～0.05）mm 的聚丙烯塑料袋。 以上聚丙烯塑料袋均要求符合GB 4806.7规定。 装袋（瓶） 采用装袋（瓶）机或人工进行装袋（瓶），人工装袋（瓶）需用打孔器在袋口处打孔，孔直径1 cm～ 1.5 cm、深度为8 cm～12 cm，每袋（瓶）装培养基质500 g～600 g，塑料袋用无棉盖体套环或窝口海 绵塞封口，培养基质装袋（瓶）后4 h内进行灭菌。 灭菌 可采用高压灭菌和常压灭菌。 高压灭菌：组合培养料在121 ℃～122 ℃（0.11MPa～0.12 MPa）下灭菌2 h；粮食培养基在121 ℃～ 122 ℃（0.11 MPa～0.12 MPa）下灭菌2.5 h。 常压灭菌：在3 h之内使温度升至100 ℃，恒温保持10 h～12 h。 接种 3 DB15/T 2544—2022 原种、栽培种在超净工作台或接种箱内接种，接种前打开紫外灯照射30 min后吹风，接种时用75 % 酒精对超净工作台或接种箱进行表面擦拭消毒。每个原种接入2 cm～3 cm大小母种1～2块；每个栽培种 接入原种量不应少于15 g。菌种都应从容器口处接种，不应打孔多点接种。 每批接种应为单一品种，如中途换品种时采用75 %酒精对超净工作台或接种箱及接种工具进行表面 擦拭消毒。 培养 通风避光、21 ℃～28 ℃下培养。 贮存 原种和栽培种在0 ℃～4 ℃下贮存，贮存期不超过50 d。 7 检验、入库 检验 7.1.1 母种感官要求 母种感官要求见表1。 表1 大球盖菇母种感官要求 项目 要求 容器 完整、无损、洁净 棉塞或无棉盖体 干燥、整洁、松紧适度、能满足透气和过滤要求 培养基灌入量 为试管总容积的1/4，培养皿高的的1/3～1/2 菌丝生长量 长满斜面或平板 菌 菌丝体特征 菌丝洁白、绒毛状、生长致密、均匀、健壮 种 菌丝体表面 均匀、舒展、平整 外 菌丝体分泌物 无 观 菌落边缘 整齐 杂菌菌落 无 斜面背面外观 7.1.2 原种感官要求 原种感官要求见表2。 4 培养基不干缩，无积水、颜色均匀、无暗斑、无色素 DB15/T 2544—2022 表2 大球盖菇原种感官要求 项目 要求 容器 完整、无损、洁净 棉塞或无棉盖体 干燥、整洁、松紧适度、能满足透气和滤菌要求 培养基上表面距瓶（袋） 口的距离 （50±5）mm 菌丝生长量 长满容器 菌丝体特征 菌丝体白、生长旺健、整齐 菌 培养物表面菌丝体 生长均匀、无高温抑制线 种 培养基及菌丝体 紧贴瓶壁、无干缩 外 菌丝分泌物 无、允许少量无色至棕黄色水珠 观 杂菌菌落 无 子实体原基 无 7.1.3 栽培种感官要求 栽培种感官要求见表3。 表3 大球盖菇栽培种感官要求 项目 要求 容器 完整、无破损 棉塞或无棉盖体 干燥、整洁、松紧适度、能满足透气和滤菌要求 培养基上表面距瓶（袋） 口的距离 （50±5）mm 菌丝生长量 长满容器 菌 菌丝体特征 生长均匀、色泽一致、无角变、无高温抑制线 种 培养基及菌丝体 紧贴瓶壁、无干缩 外 菌丝分泌物 无 观 杂菌菌落 无 子实体原基 允许少量、出现原基种类小于等于5% 入库 菌种检验完成后及时入菌种库，详细记录各生产环节，菌种库温度0 ℃～4 ℃，避光，适当通风， 定期对空间进行杀菌处理。 5