ICS 65.020.20 CCS B 21 15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 2593—2022 冰草组织培养技术规程 Technical code of practice for tissue culture of agropyron cristatum 2022-06-24 发布 2022-07-24 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发 布 DB15/T 2593—2022 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由内蒙古自治区林业和草原局提出并归口。 本文件起草单位：中国农业科学院草原研究所、内蒙古农业大学。 本文件主要起草人：徐春波、王勇、赵海霞。 I DB15/T 2593—2022 冰草组织培养技术规程 1 范围 本文件规定了冰草组织培养的术语与定义、培养基、外植体、愈伤组织诱导培养、增殖培养、分化 培养、生根培养、炼苗与移栽等基本内容及技术要求。 本文件适用于冰草组织培养育苗。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 603 化学试剂 试验方法中所用制剂及制品的制备 NY/T 2306-2013 花卉种苗组培快繁技术规程 DB 15/T 1940-2020 西部沙樱组织培养技术规程 3 术语和定义 NY/T 2306界定的术语和定义适用于本文件。 冰草 agropyron cristatum (L.) gaertn 属于禾本科（Gramineae）冰草属（Agropyron）多年生草本植物。 幼穗 young ear 生长2至5年、长度1 cm～3 cm的冰草孕穗。 种子 seed 有生活力、饱满的包含内外稃的冰草种子。 成熟胚 mature embryo 完熟期冰草种子的胚。 4 环境与器具灭菌 1 DB15/T 2593—2022 参照DB15/T 1940执行。 5 培养基 基本培养基 MS培养基、1/2MS、改良MS培养基见附录A。 母液的配制和保存 5.2.1 配制 将常用试剂配制成50～100倍的母液，按照GB/T 603规定方法配制。所用激素均配制浓度为0.5 mg/mL，配制方法详见附录B。 5.2.2 保存 母液配制好分别贴上标签，注明溶液名称、配制倍数、配制日期、配制者。母液贮存在4 ℃的冰箱 中。贮藏时间在3个月之内，有霉菌和沉淀产生，则不得使用。 培养基的配制 5.3.1 配制 配置1 L培养基时，先加蒸馏水600 ml～700 ml，再加入7.5 g琼脂，加热搅拌琼脂融化后加入25 g 蔗糖，搅拌溶解后再分别加入母液，搅拌均匀，加蒸馏水定容至1 L。 5.3.2 pH 值调节 用1 mol/L的NaOH将配制好的培养基调到pH值5.8～6.0，用酸度计或精密pH试纸测定。 5.3.3 分装和灭菌 配制好的培养基趁热分装。分装量以占培养容器的1/4～1/3为宜。切勿将培养基沾到瓶口和外壁上， 以免招致杂菌污染。分装后立即加盖，不同的处理做好标记。分装后进行灭菌，121 ℃状态下保持20 min。 6 外植体 外植体选择 幼穗或成熟胚。 外植体制备 6.2.1 幼穗 在超净台上用75%酒精脱脂棉球擦洗叶鞘表面消毒，剥出幼穗，切成0.3 cm～0.5 cm的小段。 6.2.2 成熟胚 2 DB15/T 2593—2022 种子用水浸泡2 h～4 h后，剥去内外稃，置于湿滤纸上吸胀4 h。在超净工作台上75%酒精消毒30 s， 无菌水冲洗至少3次后用0.2%升汞消毒5 min，再用无菌水冲洗数次至少3次。置于铺有湿无菌滤纸的培 养皿中，用解剖针从盾片处挑出胚。 7 愈伤组织诱导培养 幼穗 7.1.1 培养基 幼穗愈伤组织诱导培养基为改良MS+2.0 mg/L 2，4-D。 7.1.2 接种 2 2 将幼穗段接种在愈伤组织诱导培养基上，每2.5 cm ～3 cm 接种1个，均匀摆放，封好皿口，标明名 称和日期。 7.1.3 培养条件 24 ℃～26 ℃暗培养。 7.1.4 培养时间 培养20 d～30 d。 成熟胚 7.2.1 培养基 成熟胚愈伤组织诱导培养基为MS＋0.2 mol/L甘露醇+ 2.0 mg/L 2，4-D。 7.2.2 接种 2 2 将成熟胚接种在愈伤组织诱导培养基上，每1.5 cm ～2 cm 接种1个，均匀摆放，封好皿口，标明名 称和日期。 7.2.3 培养条件 见本文件7.1.3。 7.2.4 培养时间 培养14 d～20 d。 8 增殖培养 幼穗 8.1.1 培养基 幼穗增殖培养基为改良MS+2.0 mg/L2，4-D+0.2 mg/L 6BA。 8.1.2 接种 3 DB15/T 2593—2022 2 2 在超净工作台上，将诱导出的愈伤组织转到增殖培养基上，每4 cm ～5 cm 接种1个，均匀摆放，封 好皿口，标明名称和日期。 8.1.3 培养条件 见7.1.3。 8.1.4 培养时间 培养40 d～50 d；每20 d换1次培养基。 成熟胚 8.2.1 培养基 成熟胚增殖培养基为MS＋0.2 mol/L甘露醇+2.0 mg/L 2，4-D+0.3 mg/L ABA。 8.2.2 接种 2 2 在超净工作台上，将诱导出的愈伤组织转到增殖培养基上，每3 cm ～4 cm 接种1个，均匀摆放，封 好皿口，标明名称和日期。 8.2.3 培养条件 见7.1.3。 8.2.4 培养时间 培养40 d～60 d；每20 d换1次培养基。 9 分化培养 幼穗 9.1.1 培养基 幼穗分化培养基为MS+3.0 mg/L KT+0.5 mg/L NAA。 9.1.2 接种 2 2 在超净工作台上，挑选状态较好的胚性愈伤组织转入分化培养基，每5 cm ～6 cm 接种1个，均匀摆 放，封好瓶口，标明名称和日期。 9.1.3 培养条件 24 ℃～26 ℃，全天光照培养，光照强度3000 Lux～4000 Lux。 9.1.4 培养时间 培养40 d～60 d；每20 d换1次培养基。 成熟胚 9.2.1 培养基 4 DB15/T 2593—2022 成熟胚分化培养基为MS＋3.0 mg/L KT＋1.0 mg/L NAA。 9.2.2 接种 在超净工作台上，挑选状态较好的胚性愈伤组织转入分化培养基，每5 cm2～6 cm2接种1个，均匀 摆放，封好瓶口，标明名称和日期。 9.2.3 培养条件 24 ℃～26 ℃，每天光照时间16 h，光照强度3000 Lux～4000 Lux。 9.2.4 培养时间 培养60 d～90 d；每20 d换1次培养基。 10 生根培养 幼穗 10.1.1 培养基 幼穗生根培养基为改良1/2 MS+0.1 mg/L NAA。 10.1.2 接种 在超净工作台上，将长至3 cm～4 cm的小苗逐一转入生根培养基，每器皿接种1苗，封好瓶口，标 明名称和日期。 10.1.3 培养条件 见9.1.3。 10.1.4 培养时间 培养20 d～30 d。 成熟胚 10.2.1 培养基 成熟胚生根培养基为1/2 MS＋0.5 mg/L NAA。 10.2.2 接种 在超净工作台上，将长至3 cm～4 cm的小苗逐一转入生根培养基中，每器皿接种1苗，封好瓶口， 标明名称和日期。 10.2.3 培养条件 见9.2.3。 10.2.4 培养时间 培养20 d～30 d。 5 DB15/T 2593—2022 11 炼苗与移栽 炼苗 选择生长健壮的组培苗，打开封口膜，放在自然光、室温下2 d～3 d。 基质 营养土与蛭石1:1混合。经高压灭菌后装入花盆备用。 移栽 取出组培苗，洗掉培养基，栽入花盆，浇水，放入温室，套上带孔的塑料袋保湿，一周后取掉，适 当保温，常规管理。待苗长至20 cm～30 cm移栽至大田。 6 DB15/T 2593—2022 A A 附 录 A （规范性） 基本培养基成分 基本培养基成分见表A.1 。 表A.1 基本培养基成分 类型 大量元素 微量元素 组分 MS 培养基 改良 MS 培养基 KNO3 1900.0 1900.0 NH4NO3 1650.0 956.0 MgSO4·7H2O 370.0 370.0 KH2PO4 170.0 1160.0 CaCl2·2H2O 440.0 96.0 MnSO4·4H2O 22.30 22.30 ZnSO4·7H2O 8.600 8.600 H3BO3 6.200 6.200 KI 0.830 0.830 Na2MoO4·6H2O 0.250 0.250 CuSO4.5H2O4 0.025 0.025 CoCl2.6H2O 0.025 0.025 Na2-EDTA 37.30 37.30 FeSO4.7H2O 27.80 27.80 甘氨酸 2.000 2.000 盐酸吡哆辛 0.500 0.500 盐酸硫铵素 0.100 2.000 烟酸 0.500 1.000 肌醇 100.0 100.0 尼克酸 ---- ---- 铁盐 有机物 7 DB15/T 2593—2022 B B 附 录 B （规范性） 激素的配制 激素配置方法见表B.1 。 表B.1 激素配置方法 类别 名称 配制方法 灭菌方式 存储方式 2，4-二氯苯氧乙酸 （2，4-D） 生长素 用适量无水乙醇溶解后加入去离 子水定容。 高温灭菌 冷藏（4℃）， 密封，避光保存 萘乙酸（NAA） 6-苄基嘌呤（6-BA） 细胞分裂素 用适量 0.1M 的盐酸（HCL）溶解 后加入去离子水定容。 高温灭菌 冷藏（4℃）， 密封，避光保存 激动素（KT） 脱落酸 8 脱落酸（ABA） 用适量无水乙醇溶解后加入去离 子水定容。 过滤灭菌 现配现用