ICS 65.020.01 CCS B 25 15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 2602—2022 苜蓿中咪草烟残留量的测定 高效液相色谱法 Determination ofImazethapyr residue in alfalfa-Highperformance liquid chromatography 2022-06-24 发布 2022-07-24 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发 布 DB15/T 2602—2022 目 次 前言 ................................................................................. II 1 范围 ............................................................................... 1 2 规范性引用文件 ..................................................................... 1 3 术语和定义 ......................................................................... 1 4 原理 ............................................................................... 1 5 试剂和材料 ......................................................................... 1 6 仪器和设备 ......................................................................... 2 7 试样制备 ........................................................................... 2 8 测定步骤 ........................................................................... 2 9 结果计算和表示 ..................................................................... 3 10 精密度 ............................................................................ 4 附录 A（资料性） 高效液相色谱法测定咪草烟标准溶液色谱法 ............................... 5 I DB15/T 2602—2022 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC 19）归口。 本文件起草单位：中国农业科学院草原研究所、内蒙古自治区农畜产品质量安全中心、内蒙古自治 区产品质量检验研究院、太仆寺旗现代农牧业综合服务中心。 本文件主要起草人：吴洪新、王文曦、云颖、盈盈、付慧、黄奕颖、杨红东、姚继红、王冠、云岩 春、张慧泽、刘洪林、卫媛、李薇、李润航、降晓伟、李坤娜、张燕东、刘宇宁、湖日尔、刘江英、赵 志惠。 II DB15/T 2602—2022 苜蓿中咪草烟残留量的测定 高效液相色谱法 1 范围 本文件规定了高效液相色谱法测定苜蓿中咪草烟残留量的原理、试剂和材料、仪器和设备、试样制 备、测定步骤、结果计算和表示、精密度。 本文件适用于苜蓿中咪草烟残留量的测定。 本文件的检出限为0.025 mg/kg。 本文件的定量限为0.10 mg/kg。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 14699.1 饲料采样 GB/T 20195 动物饲料试样的制备 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 原理 试样中咪草烟残留物样品经过甲醇和碳酸钠提取液提取、离心、萃取、旋蒸，用离子交换型（SCX） 固相萃取小柱净化，甲醇和氨水洗脱，用高效液相色谱仪测定，外标法定量。 5 试剂和材料 乙腈（CH3CN）：色谱纯。 甲醇（CH3OH）：色谱纯。 磷酸（H3PO4）：优级纯。 二氯甲烷（CH2Cl2）。 冰乙酸（CH3COOH）：优级纯。 氨水（NH4OH）。 无水硫酸钠（Na2SO4）：优级纯。 碳酸钠（Na2CO3）：优级纯。 碳酸钠溶液（0.1mol/L）：称取 10.6 g 碳酸钠，用水溶解，定容至 1 L 容量瓶中。 1 DB15/T 2602—2022 甲醇-碳酸钠溶液（1+1，v/v）：量取 100 mL 甲醇，加入 100 mL 碳酸钠溶液（5.9），混匀。 磷酸溶液（1+9，v/v）：量取 10 mL 磷酸，用水稀释定容至 100 mL。 氨水-甲醇（1+9，v/v）：量取 10 mL 氨水，加入 90 mL 甲醇，混匀。 水+甲醇（1+9，v/v）：量取 10 mL 水，加入 90 mL 甲醇，混匀。 乙酸溶液（5+95，v/v）：量取 5 mL 冰乙酸，用水稀释定容至 100 mL。 标准品：咪草烟（C15H19N3O3）：纯度不小于 95%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物 质。 标准储备液(1.00 mg/mL)：准确称取适量的咪草烟标准物质，用甲醇溶解并配制成(1.00 mg/mL) 的标准储备液，保存于-18 ℃冰箱内，可使用 6 个月。 标准使用液：准确吸取 0.10 mL 咪草烟的标准储备液(5.16)至 10 mL 容量瓶内，用甲醇稀释定容 至刻度，配制成 10.0 μg/mL 的标准溶液，于-18 ℃冰箱内避光保存，可使用 1 个月。 标准系列工作液：分别吸取浓度为 10.0 μg/mL 咪草烟标准液 0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL、 1.50 mL、2.00 mL 于 10.00 mL 容量瓶，用水+甲醇(5.13)定容至刻度，该标准系列咪草烟浓度分别为 0.25 μg/mL、0.50 μg/mL、1.00 μg/mL、1.50 μg/mL、2.00 μg/mL。 固相萃取柱：SCX，60 mg/3mL。 微孔过滤膜（尼龙）：13 mm×0.22 µm。 注： 除非另有规定，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和GB/T 6682所规定的一级水。 6 仪器和设备 高效液相色谱仪：配有紫外检测器（或二极管阵列检测器）。 电子天平：感量 0.01 mg 和 0.01 g。 离心机：转速大于等于 4000 r/min。 超声波水浴。 旋转蒸发仪。 涡旋混合器。 氮吹仪。 组织粉碎机。 样品筛：筛孔尺寸 1.0 mm。 7 试样制备 按照GB/T 14699.1中有关规定采集样品，去杂质后充分混匀，按照GB/T 20195制备试样，利用四分 法取样后，充分研磨，过1.0 mm筛，新鲜样品利用四分法取样后，充分破碎作为分析样品备用，将处理 好的试样放置-18℃冰箱保存。 8 测定步骤 提取 准确称取苜蓿新鲜样品5 g（精确至0.01g）或草粉2 g（精确至0.01g）于50 mL的塑料离心管中， 加入30 mL的甲醇-碳酸钠溶液（5.10），混匀，超声提取30 min，用磷酸溶液（5.11）调至pH=2.5，于 4000 r/min离心10 min，收集上清液于分液漏斗中，用50 mL二氯甲烷（5.4）萃取两次（25 mL+25 mL）， 2 DB15/T 2602—2022 有机相加适量无水硫酸钠（5.7）除水后收集于旋转蒸发瓶中，于45 ℃减压蒸至近干，加适量甲醇（5.2） 溶解。 净化 强阳离子交换固相萃取柱SCX（5.19）净化，用1 mL水、1 mL甲醇（5.2）活化固相萃取柱，试样全 部过柱，用1 mL水、1 mL甲醇（5.2）淋洗固相萃取柱，再用6 mL氨水-甲醇（5.12）洗脱，收集流出液 于10 mL比色管中，整个固相萃取过程流速不超过1 mL/min 。洗脱液于50 ℃条件下氮吹至近干，用2.00 mL水-甲醇（5.13）溶解、涡旋混匀，过0.22 μm微孔过滤膜（5.20），待测。 测定 8.3.1 相液色谱测定参考条件 液相色谱法测定参考条件如下： a) 色谱柱：C18 型柱，长 150 mm，内径 3.9 mm，粒径 5 μm，或等效的色谱柱； b) 流动相：A:乙酸（5.14）+B:乙腈（5.1）= 60+40（v/v）； c) 流速：1.0 mL/min； d) 进样量：10.00 μL； e) 柱温：40 ℃； f) 检测波长：258 nm。 8.3.2 标准曲线的制作 按照8.3.1测定条件，将标准工作液（5.18）注入高效液相色谱仪中进行测试。测定相应的峰面积， 以标准工作液（5.18）的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。 8.3.3 试样溶液的测定 按照8.3.1测定条件，将待测样品溶液注入高效液相色谱仪中进行测试。待测样品溶液中目标物质 的响应值应在仪器线性范围内，否则应适当稀释。标准工作液与待测样品溶液等体积进样。根据标准溶 液色谱峰的保留时间和峰面积，对试样溶液的色谱峰根据保留时间进行定性，外标法定量。咪草烟标准 溶液色谱图见附录A中图A.1。 平行实验 按上述步骤，对同一试样进行平行试验测定。 空白实验 除不称取试样外，均按上述分析步骤进行。 9 结果计算和表示 试样中咪草烟含量X按式（1）计算： X= （C-C0）×V m ······································································ (1) 式中： X ——试样中咪草烟的含量，mg/kg； 3 DB15/T 2602—2022 C ——待测液中咪草烟的浓度，µg/mL； C0——试剂空白； V ——试样溶液定容体积，mL； m ——试样的称样量，g。 注： 测定结果用算术平均值表示，保留两位有效数字。 10 精密度 在实验室内重复性条件下获得的 2 次独立测定结果的绝对差值不超过算数平均值 10%。 在实验室间再现性条件下获