ICS 65.150 CCS B 52 22 吉 林 省 地 方 标 准 DB 22/T 3386—2022 小球藻发酵培养技术规范 The technical specification for fermentation culture of freshwater chlorella vulgaris 2022 - 06 - 23 发布 2022 - 07 - 23 实施 吉林省市场监督管理厅 发 布 DB 22/T 3386—2022 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件中的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由吉林省农业农村厅提出并归口。 本文件起草主要单位：吉林农业大学，吉林省水产技术推广总站、通化师范学院。 本文件主要起草人：张东鸣、陈玉珂、蔺丽丽、王秋举、郭志欣、刘洪建、赵云龙、高永生。 I DB 22/T 3386—2022 小球藻发酵培养技术规范 1 范围 本文件规定了小球藻（Chlorella vulgaris）发酵培养的仪器设备与耗材，培养基，培养，测定生 物量和采收。 本文件适用于淡水小球藻设施发酵培养。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB 11607 渔业水质标准 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 扩大培养 expand culture 培养基中接种少量的藻种，在适宜环境条件（温度、盐度、光照、pH 值等）下，藻液达到一定的 浓度后，一次性采收或作进一步扩大培养的过程。 发酵培养 fermentation culture 小球藻通过生物氧化反应获得能量以维持藻细胞生长的过程。 4 仪器设备与耗材 仪器设备 小球藻发酵培养仪器设备应满足下列要求： a) 发酵罐,容量不低于 50 L； b) 恒温干燥箱，不低于 2000 W； c) 高压灭菌器,灭菌体积不低于 50 L； d) 高速离心机，转速不低于 5000 r/min，离心体积不小于 500 mL； e) 充气泵，功率大于 200 W。 耗材 玻璃三角烧瓶，培养皿，离心管。 1 DB 22/T 3386—2022 5 培养基 扩大培养用 BG-11 培养基，主要成分见表 1。 表1 BG-11 培养基组成 贮存液 1 2 a b 配制体积（mL） 成分 含量（g） NaNO3 (+N) / NaCl (-N) 30/20.6 K2HPO4·3 H2O 0.80 Na2CO3 0.40 柠檬酸 0.30 柠檬酸铁铵 0.30 EDTA-Na2 0.05 1000 100 工作液体积（mL） 50 2 3 100 CaCl2·2H2O 1.80 2 4 100 MgSO4·7H2O 3.75 2 H3BO3 2.86 MnCl2·4H2O 1.81 CuSO4·5H2O 0.079 Na2MoO4·2H2O 0.391 Co(NO3)2·6H2O 0.04947 ZnSO4·7H2O 0.222 HEPES 缓冲液 119.15 5 6 1000 c 1 1000 a 贮存液 1 用 2 mol/L 的 NaOH 调 pH 到 7.4 ～ 8.0； b 贮存液 2 易生菌，高压灭菌后保存于 4 ℃； c 贮存液 6 为保种时用，平时培养可不加。 40 发酵培养的培养基主要成分见表 2。 表2 发酵培养基组成 贮存液 2 成分 含量 1 葡萄糖 41.53 g/L 2 尿素 4.14 g/L 3 KH2PO4 0.7 g/L 4 MgSO4·7H2O 0.7 g/L 5 Na2HPO4·12H2O 1.84 g/L 6 CaCl2 母液 5 mL 7 Fe-EDTA 母液 15 mL 8 微量元素母液 1.84 mL DB 22/T 3386—2022 6 培养 水质 水质符合 GB 11607 的要求。 扩大培养 6.2.1 藻种 小球藻纯度 ≥ 99.99 %。 6.2.2 接种 无菌环境下，将已无菌的 600 mL BG-11 培养基装入 1 L 已灭菌处理的玻璃三角烧瓶中，然后将 6 200 mL 密度达到 10 ind/mL 的小球藻接种于 BG-11 培养基中。 6.2.3 培养条件 pH 6.5，培养温度 28 ℃，充气量 1.5 L/min, 培养时间为 96 h。 发酵培养 6.3.1 接种 在 50 L 发酵罐中进行发酵培养，接种量为 10%，将 3 L 扩大培养的小球藻藻种接入 27 L 发酵 培养基中。 6.3.2 培养条件 装料体积 30 L，温度 28 ℃，搅拌速度 150 r/min ~ 300 r/min，发酵时间 96 h。 6.3.3 补料 在发酵培养达 36 h 时向发酵罐内补充 30 g/L 葡萄糖；在发酵培养达 60 h 时向发酵罐内补充 10 g/L 尿素，培养至满 96 h 结束。 7 测定生物量 取 8 mL 藻液装入 10 mL 离心管中以 8000 r/min 离心 10 min，弃上清，再用蒸馏水混悬藻泥，离 心弃上清，重复三遍。将藻泥用少量蒸馏水洗入预先称重的培养皿中敞口置于 80 ℃ 烘箱中烘至恒重， 称重。 8 采收 培养体积较大时可通过加入絮凝剂絮凝，过滤后干燥收集；培养体积较小时可使用离心机在 8000 r/min，4 ℃ 条件下离心 10 min 收集。 3