ICS 11.220 B 41 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3468—2019 猪轮状病毒间接ELISA 抗体检测方法 Indirect enzyme-linked immunosorbent assay for detection of antibodies against porcinerotavirus 行业标准信息服务平台 2019-08-01发布 2019-11-01实施 中华人民共和国农业农村部 发布 NY/T 3468—2019 前 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由农业农村部畜牧兽医局提出。 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SATVTC181）归口。 本标准起草单位：东北农业大学、中国动物卫生与流行病学中心。 本标准起草人：王丽、乔薪瑷、李一经、邵卫星、姜艳平、魏荣、王岩、李晓成、唐丽杰、崔文、孙映雪、吴 发兴。 行业标准信息服务平台 I NY/T3468—2019 猪轮状病毒间接ELISA抗体检测方法 1范围 本标准规定了猪轮状病毒间接ELISA抗体检测方法的试剂、仪器和设备、试验程序、试验结果的判定 方法以及注意事项。 本标准适用于猪轮状病毒抗体检测，用于猪轮状病毒感染的流行病学调查和分析。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB19489实验室生物安全通用要求 GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫 NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 中华人民共和国农业部公告第302号兽医实验室生物安全技术管理规范 3设备和器材 3.1酶标测定仪 3.2恒温培养箱 3.3冰箱(4℃、-20℃) 3.4离心机 3.5微量移液器 量程：20μL~200μL、100μL~1000μL。 3.6酶标板 行业标准信息 3.7一次性注射器 量程：5mL。 4试剂 4.1猪轮状病毒VP6蛋白 VP6蛋白的表达与纯化见附录A。 4.2标准阳性血清 猪轮状病毒疫苗免疫仔猪制备，血清经病毒中和试验检测为阳性。 4.3标准阴性血清 无母源抗体、未免疫猪轮状病毒疫苗的15日龄～30日龄仔猪血清。血清经病毒中和试验检测，中和 效价不大于1：4。 4.4包被液 配制见附录中的B.1。 4.5磷酸盐缓冲液(PBS液） 配制见B.2。 4.6洗涤液 配制见B.3。 4.7封闭液 1 NY/T 3468—2019 配制见B.4。 4.8血清稀释液 配制见B.5。 4.9底物显色液 配制见B.6。 4.10终止液 配制见B. 7。 4.11辣根过氧化物酶标记的山羊抗猪IgG、脱脂乳、TMB等 均为商品化试剂。 5血清样本的处理 PUBI TAND 6间接ELISA抗体检测操作方法 6.1包被抗原 将纯化的VP6蛋白用包被液稀来 希释至3ugm每孔100包被酶标板，封口 包被12h。 801 250止洗涤液振荡洗涤3次，每min 包被结束后，弃去包被液，每孔加 L 6.2封闭 封闭结束后舞头板中封闭液每孔加人洗涤液 T 每孔加人封闭液250 37℃恒温箱封闭2h RC 8℃保存备用 6.3加样 加人100L.同时加人 和阳性对照血清各2孔， 将待检血清用稀释液作士：100稀释 培养箱中反应1 100μL/孔。置于37℃ 洗板同王 C 6.4加酶标抗体 将山羊抗猪酶标抗体用统体稀释液稀释至工作浓度每孔加人 100ml 洗板同上。 6.5显色 10 min。 每孔加人100L底物显色液轻轻摇 37C避光 6.6终止反应 每孔加人100μL终止液终止反应。 6.7读数 在酶标仪上读取450nm吸光值（OD50 7试验结果的判定 7.1试验成立条件 在酶标测定仪上检测各孔光吸收值（OD450），计算阳性对照平均ODt50和阴性对照平均OD450。阳性 对照血清平均OD450>0.6,阴性对照血清平均OD450<0.16，试验成立。 7.2结果判定 计算待测样品孔平均OD45o和阴性对照孔平均OD450之比。当样品孔平均OD450（P）与阴性对照平均 OD50（N)之比不小于2.0(即P/N≥2.0)时，判定为猪轮状病毒抗体阳性；当样品孔平均OD450（P)与阴 性对照平均OD450(N)之比小于2.0(即P/N<2.0)时,判定为猪轮状病毒抗体阴性。 8注意事项 8.1所有操作应严格按照GB19489和GB/T27401的规定进行。 2