ICS 65.020.01 CCS B 16 15 内蒙古自治区 地方 标准 DB15/T 2958—2023 马铃薯黑痣 病菌PCR检测方法 Detection of pathogenic fungus for potato black scurf by PCR method 2023-04-26发布 2023-05-26实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发布 DB15/T 2958 —2023 I 目次 前言 ................................ ................................ ................. II 1 范围 ................................ ................................ ............... 1 2 规范性引用文件 ................................ ................................ ..... 1 3 术语和定义 ................................ ................................ ......... 1 4 原理 ................................ ................................ ............... 1 5 试剂与仪器 ................................ ................................ ......... 1 试剂 ................................ ................................ ........... 1 溶液配制 ................................ ................................ ....... 2 仪器 ................................ ................................ ........... 2 6 操作步骤 ................................ ................................ ........... 2 对照的设立 ................................ ................................ ..... 2 样品制备 ................................ ................................ ....... 2 马铃薯组织样品 DNA提取 ................................ ......................... 2 PCR扩增 ................................ ................................ ........ 2 7 琼脂糖凝胶电泳 ................................ ................................ ..... 3 8 结果 ................................ ................................ ............... 3 试验成立的条件 ................................ ................................ . 3 结果判定 ................................ ................................ ....... 3 DB15/T 2958 —2023 II 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由内蒙古自治区农牧厅提出。 本文件由内蒙古自治区马铃薯标准化技术委员会（ SAM/TC 40 ）归口。 本文件起草单位：内蒙古自治区产品质量检验研究院、内蒙古中加农业生物科技有限公司、乌兰察 布市检验检测中心、内蒙古朱日和镇综合保障和技术推广中心。 本文件主要起草人：刘广晶、刘晓权、张之为、高晓娟、包美丽、赵莉、高俊、吕文霞、孙翠翠、 王斌、齐桂敏、任玮、孙辉远、侯晓云、赵欣、姜涛、常青、李建青、王勐、徐晓、张利萍、李艺凡、 姚婷、梁敏。 DB15/T 2958 —2023 1 马铃薯黑痣病菌 PCR检测方法 1 范围 本文件规定了马铃薯黑痣病菌 PCR检测方法。 本文件适用于马铃薯植株茎秆、块茎等组织中黑痣病菌的检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 马铃薯黑痣病 potato black scurf disease 由丝核菌属立枯丝核菌（ Rhizoctonia solani K ühn）引起，可通过病薯上或留在土壤中的菌核越 冬，带病种薯是远距离传播的主要载体。马铃薯生 长期间病菌从土壤中根系或茎基部伤口侵入，引起发 病。主要危害马铃薯幼芽、茎基部及块茎，会造成马铃薯缺苗断垄，发病严重时将导致植株死亡。该病 菌既可侵染马铃薯植株地上茎基部又可侵染地下块茎。在地上茎基部可形成白色霉层，而在地下块茎上 则可形成大小数量不等的黑色菌核，严重影响马铃薯块茎品质和商品价值。 4 原理 本文件采用聚合酶链式反应（ Polymerase Chain Reaction ，PCR）方法检测马铃薯黑痣病菌。其原 理是：以马铃薯黑痣病菌 ITS序列区设计特异性引物，以基因组 DNA 为模板，在 Taq DNA聚合酶的作用 下进行PCR扩增，根据 PCR扩增结果判断该样品中是否含有目的片段，从而达到鉴定马铃薯黑痣病菌的目 的。 5 试剂与仪器 试剂 5.1.1 以下所有试剂，除另有规定外，均使用分析纯试剂；水为符合 GB/T 6682 中规定的一级水。 5.1.2 植物基因组提取试剂盒、 50×TAE电泳缓冲液、 2×Taq PCR Master Mix 、无水乙醇、溴化乙锭、 DNA Marker 、6×DNA Loading Buffer 等均从试剂公司购买。 DB15/T 2958 —2023 2 溶液配制 5.2.1 溴化乙锭溶液（ 10 mg/mL ） 称取溴化乙锭 100 mg，加水溶解，定容至 10 mL。 5.2.2 1×TAE电泳缓冲液 量取50×TAE电泳缓冲液 20 mL，加水定容至 1 L。 5.2.3 1.5%琼脂糖凝胶 称取1.5 g琼脂糖， 加入 100 mL的1×TAE电泳缓冲液， 微波炉加热至琼脂糖融化， 待溶液冷却至 50 ℃ 左右时，加入 5 μL溴化乙锭溶液，摇匀，倒入制胶板中均匀铺板，凝固后取下梳子，备用。 仪器 PCR仪、台式高速离心机（离心力 1180 g～12470 g）、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像仪、水浴锅、 移液器，高压蒸汽灭菌锅、 4 ℃冰箱、普通天平（感量 0.01 g）。 6 操作步骤 对照的设立 检测体系以马铃薯黑痣病 菌的DNA作为阳性对照，以不添加 DNA模板的反应体系作为阴性对照。 样品制备 一块地取发病马铃薯茎秆或块茎组织，将样品保存于 4 ℃冰箱中， DNA提取时取马铃薯茎秆或块茎 组织0.1 g，样品需现用现取。 马铃薯组织样品 DNA提取 将样品置于灭过菌的研钵中，加液氮研磨成粉末，转至 1.5 mL离心管，利用植物基因组 DNA提取试 剂盒提取。 PCR扩增 6.4.1 PCR扩增引物 以核糖体 5.8S rDNA 和28S rDNA 基因的间隔序列 ITS:（Intergenic Transcribed Spacer ）设计引 物，引物序列 如下： 上游引物： 5’-TTGGTTGTAGCTGGTCTATTT -3’。 下游引物： 5’-TATCACGCTGAGTGGAACCA -3’。 扩增片段大小为 500 bp。 用水将上、下游引物分别配制成工作浓度为 10 ng/μL的溶液。 6.4.2 PCR反应体系 马铃薯黑痣病菌 PCR扩增反应体系如表 1所示，按照以下顺序加入相应试剂到 PCR管中，混匀并离心 10 s，使混合液都沉降到 PCR管底。详见表 1。