ICS 65.020.01 CCS B 04 15 内蒙古自治区 地方 标准 DB15/T 2995—2023 牧草中抗坏血酸的测定 邻苯二胺荧光法 Determination of ascorbic acid in forage grass o-phenylenediamine fluorometry 2023-05-11发布 2023-06-11实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发布 DB15/T 2995 —2023 I 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（ SAM/TC 19 ）归口。 本文件起草单位：中国农业科学院草原研究所、内蒙古自治区农畜产品质量安全中心、乌海市农畜 产品质量安全中心、锡林郭勒盟农牧业科学研究所、阿拉善盟农畜产品质量安全中心。 本文件主要起草人：王文曦、吴洪新、云颖、康博洋、盈盈、刘宇宁、湖日尔、张燕东、赵丽君、 刘鹏斌、李润航、朝鲁孟、刘江英、刘洪林、卫媛、降晓伟、赵志惠、李坤娜、李薇、付慧。 DB15/T 2995 —2023 1 牧草中抗坏血酸的测定 测定 邻苯二胺荧光法 1 范围 本文件规定了新鲜牧草中 的抗坏血酸邻苯二胺荧光光度的测定方法。 本文件适用于新鲜牧草中抗坏血酸的测定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 14699.1 饲料采样 GB/T 20195 动物饲料试样的制备 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 原理 试样L(+)-抗坏血酸经活性炭氧化为 L(+)-脱氢抗坏血酸后，与邻苯二胺反应生成有荧光的喹唔啉， 其荧光强度与 L(+)-抗坏血酸的浓度在一定条件下成正比，以此测定试样中 L(+)-抗坏血酸 总量。 5 试剂和材料 冰乙酸(CH3COOH)：浓度约为 30%。 偏磷酸(HPO 3)n：含量(以HPO3计)不小于38%。 乙酸钠(CH3COONa)。 硼酸(H3BO3)。 邻苯二胺 (C6H8N2)。 酸性活性炭粉：称取约 200 g活性炭粉（ 75 μm～177 μm），加入 1 L盐酸（1+9），加热回流 1 h～2 h，过滤，用水洗至滤液中无铁离子为止，置于 110 ℃～120 ℃烘箱中干燥 10 h，备用。检验 铁离子方法：利用普鲁士蓝反应。将 20 g/L亚铁氰化钾与 1%盐酸等量混合，将上述洗出滤液滴入，如 有铁离子则产生蓝色沉淀。 偏磷酸-乙酸溶液：称取 15 g偏磷酸,加入40 mL冰乙酸及 250 mL水，加温，搅拌使之逐渐溶解， 冷却后加水至 500 mL于4 ℃冰箱可保存 7 d～10 d。 DB15/T 2995 —2023 2 乙酸钠溶液 (500 g/L) ：称取500 g乙酸钠，加入水溶解至 1000 mL，冷却后，储存于聚乙烯瓶中。 硼酸-乙酸钠溶液：称取 3 g硼酸，用 500 g/L乙酸钠溶液溶解并稀释至 100 mL，临用时配制。 邻苯二胺溶液 (200 mg/L) ：称取20 mg邻苯二胺，用水溶解并稀释至 100 mL，临用时配制。 抗坏血酸标准品：抗坏血酸（ C6H8O6）纯度不小于 99%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准 物质。 抗坏血酸标准储备液（ 1000 μg/mL）：准确称取适量的抗坏血酸标准物质，用偏磷酸 -乙酸溶液 （5.7）溶解并配制成（ 1000 μg/mL）的标准储备液，该贮备液在 2 ℃～8 ℃避光条件下可保存一周。 抗坏血酸标准工作液： 抗坏血酸标准工作液 (100.0 μg/mL):准确吸取抗坏血酸标准液 10.0 mL， 用偏磷酸 -乙酸溶液（ 5.7）稀释至 100 mL，临用时配制。 水为GB/T 668 2规定的二级水。 6 仪器和设备 荧光分光光度计：具有激发波长 338 nm 及发射波长 420 nm。配有1 cm 四通比色皿。 分析天平：感量 0.01 mg和0.01 g。 组织匀浆机。 7 试样制备 按照GB/T 14699.1 中有关规定采集样品，去杂质后充分混匀，按照 GB/T 20195 制备试样，新鲜样品 利用四分法取样后，充分破碎作为分析样品。制备好的试样及时检测。 8 测定步骤 提取 称取试样 5 g～10 g（精确至 0.01 g，取样量视含量而定）于 100 mL的玻璃烧杯中，用偏磷酸 -乙酸 溶液（5.7）将其转至 100 mL的容量瓶中，定容至刻度，摇匀，为样液，另吸取 10.0 mL抗坏血酸标准工 作液（5.13）于100 mL的容量瓶中，定容至刻度，摇匀，为标准液，将样液和标准液分别全部转移至 200 mL具塞锥形瓶中，加入 2 g活性炭（ 5.6），用力振摇 1 min，过滤，弃去最初数毫升滤液，分别收集其 余全部滤液，即为试样氧化液和标准氧化液，待测定。 测定 8.2.1 分别准确吸取 5.00 mL试样氧化液于两个 50.0 mL容量瓶中， 作为 “试样液” 和 “试样空白液” 。 8.2.2 分别准确吸取 5.00 mL标准氧化液于两个 50.0 mL容量瓶中， 作为 “标准液” 和 “标准空白液” 。 8.2.3 于“试样空白液”和“标准空白液”中各加 2.5 mL硼酸-乙酸钠溶液（ 5.9），混合摇动 15 min， 用水稀释至 50.0 mL，在4 ℃冰箱中放置 2 h～3 h，取出待测。 8.2.4 于“试样液”和“标准液”中各加 2.5 mL的500 g/L乙酸钠溶液（ 5.8），用水稀释至 50.0 mL， 待测。 标准曲线的制定 准确吸取标准液氧化液 [L(+)-抗坏血酸质量浓度 10 μg/mL] 0.5 mL 、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、 分别置于 10 mL具塞刻度试管中 ,用水补充至 2.0 mL。另准确吸取“标准空白液” 2.0 mL于10 mL带盖刻