ICS 07. CCS B 7 广 T e 2022 -100.01 7 0 西 壮 中 密 e sting s p - 04 - 22 发壮族 密 度 纤 p ecifica t 发 布 广西 壮族 自 纤 维 板 t ion for 壮 族自治 区自 治 板 霉 变 mildew 区 市场监 督区 变 菌检 of medi u 督 管理局 地 D B 测技 术 u m densi 发 布 45 方 标 B 45/T 24 8 术规 范 ty fibr e 2022 - 0 布 5 标准 8 2 — 202 2 范 e board 0 5 - 25 实准 2 实 施 DB45/T 2482 —2022 II 前言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本文件由广西壮族自治区林业局提出、归口并宣贯。 本文件起草单位：广西壮族自治区林业科学研究院。 本文件主要起草人： 宋贤冲、 张照远、 王军锋、 陈文渊、 唐健、 黎小波、 王会利、 石媛媛、 郭丽梅、 邓小军、陈桂丹、黄家毅、覃祚玉、覃其云、潘波、梁杰培、陈文江。 DB45/T 2482 —2022 1 中密度纤维板霉变菌检测技术规范 1 范围 本文件规定了中密度纤维板霉变菌的术语和定义、检测方法、结果判定。 本文件适用于中密度纤维板霉变过程中产生的脉孢菌属 （Neurospora sp.） 和木霉属 （ Trichoderma sp.）真菌的定性检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件； 不注日期的引用文件， 其最新版本 （包括所有的修改单） 适用于本 文件。 GB/T 11718 中密度纤维板 NY/T 2811 橡胶树棒孢霉落叶病病原菌分子检测技术规范 3 术语和定义 GB/T 11718界定的以及下列术语和定义适用于本文件。 3.1 霉变 molding 因真菌滋生繁殖而造成中密度纤维板材质和材色的变化。 3.2 霉变菌 molding fungi 能够引起中密度纤维板材质与颜色变化的真菌总称。 4 检测方法 4.1 原理 根据中密度纤维板霉变过程中霉变菌的菌落形态、 显微形态特征， 判断霉变菌是否属于脉孢菌属和 木霉属（主要形态特征参见附录A）。 4.2 仪器设备和材料 显微镜 （ 放大倍数1 000倍 以 上 ，内 置光源， 强 度可调 ，应 具 备 数码照 相功能，数码 照 相 机的分辨 率宜在300万像素 以上）、 目镜测微 计（具有10倍的双目镜 ）、物镜（ 配备10倍、20倍、40倍、100倍 ） 生物培养箱 、冰箱、超净 工作台、 放大镜、酒精灯 、接种 钩针、玻璃刮刀、解剖针、滴瓶、 刻度吸管、 试管、三角瓶、载玻片、盖玻片、培养皿、镊子、高压蒸汽灭菌器（压力0.25 MPa ，温度138 ℃ ）、 手 术刀、聚丙烯袋、低温保存箱、电炉等。 DB45/T 2482 — 2022 2 4.3 培养基和试剂 PD A 培养基（按 NY/T 2811 的规定 配制 ） 、 无 菌 水 、75 ％乙醇 。 4.4 取样 使 用 无 菌 手 术 刀切 取中密度纤维板霉变部位， 装入无 菌 聚丙烯袋 中， 保存在 0 ℃～ 4 ℃ 的 低温保存 箱 中 带回实验室 备用， 如 不 立即处 理，则应 放置 于4 ℃环境 中 保存 。 4.5 分离 4.5.1 稀释 将 4.4中的样 品 （ 如 样 品 过 大 则应 切 取 约 2 cm× 2 cm大 小的样 品 ） 加入盛 100 mL无 菌 水 的500 mL三角 瓶 中， 振荡 10 min ， 使 样 品均匀地 分 散在稀释液 中成 为 样 品悬液 ； 吸 取1 mL 样 品悬液到 9 mL无 菌 水 中， 按10 倍 法 依次稀释 ，通常 稀释到 10-3。 在每次吸 取样 品悬液时 ，所用的 吸管在稀释液 中 反复吸入吹 出 悬 液 3～ 5次 ， 使管壁吸 附部分 饱 和以 减 少因 管壁吸 附而 造 成的 误差 ，并 使悬液进一步 分 散 。 4.5.2 涂布 先 于 已灭 菌培养 皿 中 加入 15 mL 的 PD A培养基， 凝固后 ， 用1 mL无 菌 吸管吸 取 一 定 稀释 度的样 品悬液 ， 加 0.05 mL 于培养基表 面 ， 然后立即 用 玻璃刮刀将悬液均匀地涂抹 于培养基表 面 。用 同一支吸管 接种 同 一 样 品 不 同稀释 度的 悬液时 ，应 从高稀释 度 开始 ， 然后依次 接种 较低稀释 度的 悬液 。 4.5.3 培养 将 接种了样 品悬液 的培养 皿倒置 ， 放入 30 ℃恒温 培养 箱 中培养3 d～ 5 d后 取出。 4.6 纯化 于 已灭 菌培养 皿 中 倾 注15 mL 的 PD A培养基， 凝固后 ，用 沾 有少 量 4.5培养 物 的接种 环在已凝固 培养 基表 面轻轻划线 （以不 划破琼脂为 度）。 将划线 的培养 皿倒置 ， 放入 30 ℃恒温 培养 箱 中培养3 d～ 5 d后 取出， 挑 取单 个 菌落 转 接于新的 含PD A培养基的培养 皿 中，于4 ℃ 条件下 保存 备用。 4.7 接种培养 4.7.1 培养基制备 将熔 化培养基 在超净 工作 台 中 加入直径 9 cm 的培养 皿 中， 每个 培养 皿 注 入 15 mL ， 凝固后 备用。 4.7.2 接种 将 接种 针经火焰灭 菌并 冷却后 ， 从 4.6的 转 接培养 皿 中 蘸 取 极 少 量 孢子， 点植 于4.7.1的培养基 上 ， 一般点植 成 三角 形的 三点 。 4.7.3 培养 将 接 完 种的培养 皿倒置 ， 放入 30 ℃恒温 培养 箱 中培养6 d 。 DB45/T 2482 —2022 3 4.8 菌落观察 取出培养皿， 用肉眼或放大镜观察菌落的生长或发育速度、 菌落的颜色、 菌落表面质地、 菌落边缘、 培养基颜色变化等，并记录在附录B中。 4.9 显微观察 取一片洁净的载玻片， 在中央滴一滴无菌水。 用接种针或解剖针从培养皿的纯化菌落上挑取少许含 有子实体的菌体， 放入载玻片的液滴中， 并将菌丝体挑开。用 镊子取盖玻片， 从一边轻轻加盖， 避免产 生气泡， 如果有气泡，可 在酒精灯上短时加热除去。 用显微镜观测载玻片标本中菌丝、子 实体、孢 子 等 的特征，并记录在附录B中。 5 结果判定 将4.8和4.9的观察结果 与附录A和附录C进行对照，确定菌属。 DB45/T 2482 — 2022 4 A A 附录A （资料性） 脉孢菌属和木霉属的主要形态特征 A.1 脉孢菌属 Neurospora sp. 子 囊 菌 亚门 、子 囊 菌 纲 、 粪壳 霉 目 、 粪壳 霉科的 一 属。 菌落生 长迅速 ，菌 丝蔓延 生 长 、 无色 、有 横 隔 、 多核 ，生孢子的 气 生菌 丝无 规 律地向空 中生 长 ， 呈双叉式 分 枝 。分生孢子 球 形 或近似球 形、成 链 、 单 细胞 。 子 囊壳簇 生 或散 生， 光滑或具 有 松散 菌 丝 ，呈无毛或 有 毛状 ，壁亚革质或炭质 ，褐 色或 褐黑 色 。 顶 部 突 起 处 生 孔 口 乳头 状或短 嘴 状 。子 囊壳 内最 初充满 具 分 隔 的 侧 丝 ， 当 形成子 囊时 侧 丝 消失 ， 继 后 子 囊 发 育 充满 子 囊壳 。子 囊 圆筒 形， 含 4～ 8个 孢子。 子 囊 孢子 椭圆 形， 初 期 无色 ，成 熟 时 变 为 黑 色或 墨绿 色 ，单 细胞 ， 带 有 纵 的 纹饰故 称 脉孢霉。 菌落最 初白 色 、 粉粒 状 ， 很快 变 为 淡 黄 色 、 绒 毛状 ，成 熟 时上 层覆 盖 成 团块 的分生孢子。主要 根据 子 囊壳 、子 囊 和子 囊 孢子的 大 小 进行 分 类 。 A.2 木霉属 Trichoderma sp. 半知 菌 亚门 、 丝 孢 纲 、 丝 孢 目 、 从 梗 孢科的 一 属。 菌落生 长迅速 ， 棉絮 状或 致 密 如 毡 ，产 孢 丛束 区 常 排 列成 同 心轮纹 ，表 面为 不 同 程度 绿 色 ， 反面无色或 有 色 ， 气 味 有 或无 。 主要特征 为 菌 丝 有 隔 ，分 枝 繁 复 。 分生孢子 梗 为 菌 丝 的 短 侧 枝 ， 其 上 对生 或 互 生分 枝 ，还 可有 二级 、三 级 分 枝 ，呈 锐 角或近似直角 ， 似松 柏 树 枝状 。分 枝 末端 为 束 生、 对生、 互 生 或 单生 瓶状 小 梗 。 分生孢子 在 小 梗顶端靠粘 液聚 成 球 形 或 近球 形的孢子 头 ， 有 时 几 个 孢子 头汇 成 一个大 的孢子 头 ， 分生孢子 近球 形 或 椭圆 形、 圆筒 形、 倒 卵 形 等 ， 壁光滑或 粗糙 ， 透明 或 亮 黄 绿 色 。 一 些种有 厚垣 孢子， 间 生于菌 丝 中 或 顶 生于菌 丝短 侧 分 枝上 ， 球 形、 椭圆 形