ICS 11.120.01 CCS C27 团 体 标 准 T/TPPA 0002 -2022 RBL-2H3肥大细胞 RTCA法 评价中药注射剂类过敏反应操作规程 Operating procedure for evaluating the anaphylactoid reactions of traditional Chinese medicine injection by RBL -2H3 mast cell degranulation based on RTCA 2022-12-22发布 2022-12-22实施 天津市医药行业协会 发布 全国团体标准信息平台 T/TPPA 0002-2022 目 次 前 言 ................................ ................................ ............. I 1 范围 ................................ ................................ ............... 1 2 规范性引用文件 ................................ ................................ ..... 1 3 术语和定义 ................................ ................................ ......... 1 4 检测原理 ................................ ................................ ........... 1 5 材料与设备 ................................ ................................ ......... 2 5.1 材料 ................................ ................................ ........... 2 5.2 设备 ................................ ................................ ........... 2 6 实验方法 ................................ ................................ ........... 2 6.1 溶液配制 ................................ ................................ ....... 2 6.2 实验步骤 ................................ ................................ ....... 2 7 数据处理及判定 ................................ ................................ ..... 3 全国团体标准信息平台 T/TPPA 0002-2022 I 前 言 本文件按照 GB/ T1.1-2020《标准化工作导则第 1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起 草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本文件由天津天士力之骄药业有限公司提出。 本文件由天津市医药行业协会归口。 本文件起草单位：天津天士力之骄药业有限公司、天津中医药大学、天津市药品检验研究院、天津 市中药注射剂安全性评价企业重点实验室、 创新中药关键技术国家重点实验室、 现代中医药海河实验室、 河南天地药业股份有限公司、天津红日药业股份有限公司。 本文件主要起草人：鞠爱春、张艳军、庄朋伟、华晓东、李德坤、岳洪水、张俊华、周水平、周立 华、万梅绪、王冲、徐琳、张燕欣、李智、何毅、白晓丽、马晓慧、王蕴华、黄芝娟、江昕、张松梅。 全国团体标准信息平台 全国团体标准信息平台 T/TPPA 0002-2022 1 RBL-2H3肥大细胞 RTCA法评价中药注射剂类过敏反应操作规程 1 范围 本文件规定了 RBL-2H3肥大细胞 RTCA法评价中药注射剂类过敏反应的实验方法。 本文件适用于中药注射剂通过BL-2H3肥大细胞 RTCA法对类过敏反应 的评价。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 实时细胞分析 real-time cell analysis 实时细胞分析即 RTCA，是基于电子阻抗技术，以细胞指数的形式实时反映细胞形态及结构变化， 用以监测细胞活性的检测方法。 3.2 细胞指数 cell index 细胞指数是基于电子阻抗技术，以电阻值 曲线的变化趋势 反映细胞活性的评价指标。 4 检测原理 RBL-2H3细胞常被用于检测过敏或类过敏反应。当细胞与相应的抗原结合后，细胞处于致敏态， 引起细胞膜的稳定性下降，通透性增强，分泌性颗粒由胞内分泌到胞外，即为脱颗粒，随之释放生物活 性介质如组胺、β -氨基己糖苷酶以及相应细胞因子，介导过敏或类过敏反应的发生。因而无论是 I型 过敏或类过敏反应都可通过检测 RBL-2H3细胞脱颗粒后释放的炎症介质或其信号分子来检测过敏程度， 用于评价药物是否有致敏性，进一步评价药物的致敏类型及致敏程度。 RTCA系统包括由 16孔电极板、电极槽及分析系统组成的实时、连续、定量跟踪细胞增殖分化改变 全国团体标准信息平台 T/TPPA 0002-2022 2 的细胞阻抗传感监测系统。电极板依据电阻显示实验结果，细胞接种于电极板，通过检测实时传感器表 面的电阻抗信号，测量的电阻来持续监控细胞。可对细胞进行实时监测，能反映细胞增殖、存活、形态 变化等细胞生物学状态。可实时定量地来测量加药后 RBL-2H3细胞状态，包括细胞数量、粘附、活力和 形态的改变，并提供精确的定量信息，全程实时连续动态监控。细胞的动态变化作用于电极板引起电阻 值连续的变化，实验结果根据实时测得的电阻值换算为细胞指数作为指标，通过细胞指数曲线上升及下 降等变化趋势表示电极板中细胞的变化。 肥大细胞激活不仅导致明显 的细胞形态改变，而且会引起细胞黏附能力增加，这两者在 RTCA系统 中都会引起细胞指数的上升，从而反映类过敏反应的发生。 5 材料与设备 5.1 材料 5.1.1 细胞 RBL-2H3细胞。 5.1.2 试剂试药 C48/80、DMEM培养基、胎牛血清、胰酶、青 -链霉素、 PBS缓冲液。 5.2 设备 RTCA实时细胞分析系统。 6 实验方法 6.1 溶液配制 将 DMEM培养基、胎牛血清和青 -链霉素按照 89:10:1的体积比混合均匀，即得 DMEM完全培养基， 4℃保存备用。 6.2 实验步骤 6.2.1 细胞培养 将RBL-2H3细胞加入 DMEM完全培养基中，置于 5% CO 2培养箱中 37℃培养。观察细胞的生长状态， 当细胞汇合度达 90%时，可进行传代或冻存。 6.2.2 细胞传代 将可传代的细胞从 CO2培养箱中取出，弃去培养液， PBS缓冲液清洗2～3遍，随后加入 2mL胰酶消 化液，CO2培养箱中孵育 1～2min至细胞完全脱落，迅速加入 2mL DMEM完全培养基中止消化，轻轻吹 打，将细胞收集于离心管中， 800rpm离心5min，弃上清液。计数细胞，以 1:3进行传代培养。 为保证 全国团体标准信息平台 T/TPPA 0002-2022 3 实验所用细胞的稳定性，细胞代数控制在 5～20代内。 6.2.3 细胞浓度确定 将150μL不同浓度（ 2.5×104个/mL、5.0×104个/mL、7.5×104个/mL、1.0×105个/mL、2.0×105 个/mL）的RBL-2H3细胞分别接种于16孔电极板 中，随后置于 RTCA的电极槽上在5% CO 2培养箱中 37℃ 培养，另设DMEM完全培养基作为 对照组。RTCA系统实时 监测细胞增殖 24h后，可观察到不同 浓度接种 的RBL-2H3细胞的生长曲线 及对应的细胞指数 ，选定细胞指数 为0.3～1.4的细胞浓度为最适浓度 ，用 于后续实验。 上述细胞实验均应符合 GB 19489的要求。 6.2.4 样品分组 设对照组、阳性药组和供试品组，对照组加入 DMEM完全培养基，阳性药组加入含 20μg/mL C48/80 的DMEM完全培养基，供试品组加入