ICS 11.120.01 CCS C27 团 体 标 准 T/TPPA 0001 -2022 RBL-2H3肥大细胞脱颗粒法 评价中药注射剂类过敏反应操作规程 Operating procedure for evaluating the anaphylactoid reactions of traditional Chinese medicine injection by RBL -2H3 mast cell degranulation method on Isolated IlChinese medicine injection on isolated ileum of guinea pigeum Smooth Muscle in Guinea Pig 2022-12-22发布 2022-12-22实施 天津市医药行业协会 发布 全国团体标准信息平台 T/TPPA 0001 -2022 目 次 前 言 ................................ ................................ ............. I 1 范围 ................................ ................................ ............... 1 2 规范性引用文件 ................................ ................................ .....1 3 术语和定义 ................................ ................................ ......... 1 4 检测原理 ................................ ................................ ........... 1 5 材料与设备 ................................ ................................ ......... 2 5.1 材料 ................................ ................................ ........... 2 5.2 设备 ................................ ................................ ........... 2 6 实验方法 ................................ ................................ ........... 2 6.1 溶液配制 ................................ ................................ .......2 6.2 实验步骤 ................................ ................................ .......3 7 数据处理及判定 ................................ ................................ .....5 全国团体标准信息平台 T/TPPA 0001 -2022 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 -2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起 草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本文件由 天津天士力之骄药业有限公司 提出。 本文件由 天津市医药行业协会归口 。 本文件起草单位：天津天士力之骄药业有限公司、天津大学、天津市药品检验研究院、 天津市中药 注射剂安全性评价企业重点实验室、创新中药关键技术国家重点实验室、现代中医药海河实验室、河南 天地药业股份有限公司、天津红日药业股份有限公司 。 本文件主要起草人：鞠爱春、华晓东、李德坤、岳洪水、周水平、张俊华、周立华、万梅绪、庄朋 伟、张燕欣、王冲、徐琳、李智、何毅、白晓丽、马晓慧、王蕴华、吕欣、黄芝娟、江昕、张松梅。 全国团体标准信息平台 T/TPPA 0001 -2022 1 RBL-2H3肥大细胞脱颗粒法评价中药注射剂类过敏反应操作规程 1 范围 本文件规定了 RBL-2H3肥大细胞脱颗粒的实验方法。 本文件适用于中药注射剂通过 RBL-2H3肥大细胞脱颗粒法对 类过敏反应的评价。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 组胺 histamine 组胺是一种有机含氮化合物，由组氨酸在脱羧酶的作用下产生。许多组织，特别是皮肤、肺和肠黏 膜的肥大细胞中含有大量的组胺。当组织受到损伤或发生炎症和过敏或 类过敏反应时，都可释放组胺。 组胺有强烈的刺激血管作用，并能使毛细血管和微静脉的管壁通透性增加，血浆漏入组织，导致局部组 织水肿。 3.2 β-氨基己糖苷酶 β-hexosaminidase β-氨基己糖苷酶 是一种生物活性因子 。肥大细胞受到外源刺激时，迅速释放 到组织内引起血管通 透性增加。常被作为检测过敏反应的标志物。 4 检测原理 全国团体标准信息平台 T/TPPA 0001 -2022 2 肥大细胞是类过敏反应的靶细胞 之一，在类过敏 反应中，细胞受到外源刺激，出现脱颗粒现象，释 放多种生物活性因子，如组胺、 β-氨基己糖苷酶 等，因此肥大细胞脱颗粒百分率 、组胺释放率及β-氨基 己糖苷酶释放率 为类过敏反应的 重要检测指标。 5 材料与设备 5.1 材料 5.1.1 细胞 RBL-2H3细胞。 5.1.2 试剂试药 a） 氢氧化钠、氯化钠、十二水磷 酸氢二钠、十二水磷酸二氢钠、碳酸氢钠 、邻苯二甲醛、甲醇、 盐酸，上述试剂均为分析纯。 b） C48/80、中性红、胰酶、聚乙二醇辛基苯基醚（ TritonX-100）、DMEM培养基、 胎牛血清、 PBS 缓冲液、青 -链霉素、 CCK-8检测试剂盒、 β-氨基己糖苷酶检测试剂盒。 c）水为GB/T 6682规定的三级水 。 5.2 设备 酶标分析仪、微孔板振荡培养箱。 6 实验方法 6.1 溶液配制 6.1.1 DMEM完全培养基的配制 将DMEM培养基、胎牛血清和青 -链霉素按照 89:10:1的体积比混合均匀，即得 DMEM完全培养基， 4℃保存备用。 6.1.2 2mg/mL C48/80 溶液的配制 称取C48/80加水配制成 2mg/mL C48/80溶液。 6.1.3 1%中性红染液的配制 称取中性红加水配制成 1%中性红染液。 6.1.4 0.1%邻苯二甲醛 -甲醇溶液的配制 称取邻苯二甲醛 0.05g，加甲醇溶解并定容至 50mL，避光， 4℃保存。 6.1.5 0.1mol/L 盐酸溶液的配制 全国团体标准信息平台 T/TPPA 0001 -2022 3 取盐酸加水配制成 0.1mol/L 盐酸溶液。 6.1.6 0.4mol/L 氢氧化钠溶液的配制 称取氢氧化钠加水配制成 0.4 mol/L 氢氧化钠溶液。 6.1.7 0.5% TritonX -100-PBS溶液的配制 吸取TritonX-100加PBS配制成0.5%的TritonX-100-PBS溶液。 6.1.8 基底溶液的配制 取10mg的4-硝基苯-N-乙酰基-β-D-葡糖胺溶于10mL的0.09mol/L 柠檬酸盐溶液中， -20℃保存。 6.1.9 终止液的配制 称取碳酸钠 4.2g加水溶解并定容至 100mL。 6.2 实验步骤 6.2.1 细胞培养 将RBL-2H3细胞加入 DMEM完全培养基中，置于 5% CO 2培养箱中 37℃培养。观察细胞的生长状态， 当细胞汇合度达 90%时，可进行传代或冻存。 6.2.2 细胞传代 将可传代的细胞从 CO2培养箱中取出，弃去培养液， PBS缓冲液清洗2～3遍，随后加入 2mL胰酶消 化液，CO2培养箱中孵育 1～2min至细胞完全脱落，迅速加入 2mL DMEM 完全培养基中止消化，轻轻吹 打，将细胞收集于离心管中， 800rpm离心5min，弃上清液。计数细胞，以 1:3进行传代培养。 为保证 实验所用细胞的稳定性，细胞代数控制在 5～20代内。 6.