ICS 65.020 CCS B 61 中国作物学会团体标准 T/CROPSSC 002 -2023 玉米品种纯度鉴定：InDel 分子标记法 Varietal genetic purity testing of maize (Zea mays L.): InDel marker method 2023- 06-01发布 2023- 06-01实施 中国作物学会 发布 全国团体标准信息平台 T/CROPSSC 002 -2023 1 前 言 本文件按照GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第一部分：标准化文件的结构和起草规则》规定的 相关原则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本文件由中国作物学会提出并归口。 本文件起草单位：北京市农林科学院玉米研究所、江苏省农业科学院种质资源与生物技术研究所、 北京市种子管理站、中国农业大学。 本文件主要起草人：王凤格、赵久然、许理文、田红丽、王蕊、易红梅、赵涵、葛建镕、杨扬、吴 明生、李莉、吕远大、周玲。 全国团体标准信息平台 T/CROPSSC 002 -2023 2 玉米品种纯度鉴定 : InDel分子标记法 1 范围 本文件规定了玉米品种纯度 InDel分子标记鉴定的原理、检测方案、仪器设备、试剂和溶液配制、 纯度检测程序、数据记录与结果计算和结果报告的要求。 本文件适用于玉米单交种、 自交系的品种纯度鉴定。 双交种、 三交种品种纯度鉴定也可参照本文件。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本( 包括所有的修改单) 适用于本文 件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 3543.2 农作物种子检验规程 扦样 GB/T 3543.5 农作物种子检验规程 真实性和品种纯度鉴定 GB/T 39914 主要农作物品种真实性和纯度SSR 分子标记检测 玉米 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 品种纯度 varietal genetic purity 品种在特征特性方面的典型一致的程度。 注：用该品种的应有特征种子数占供检样品种子数的百分率表示。 3.2 InDel 标记 Insertion -Deletion marker 基因组上等位基因位点处的 DNA序列在不同个体间发生了核苷酸片段的插入/ 缺失而产生的多态 性变异，可根据 InDel位点两侧的保守序列，设计特异扩增引物揭示其多态性的方法。 3.3 引物 p rimer 一条互补结合在模板DNA链上的短单链，能提供3’ -OH末端作为 DNA合成的起始点，延伸合成模板 DNA的互补链。 [来源：GB/T 39914 —2021，3.1.6] 3.4 组合引物 pane l 能够组合在一起电泳、 具有不同颜色或相同颜色而扩增产物片段大小不同的荧光标记的一组引物。 [来源：GB/T 39914 —2021，3.1.7] 全国团体标准信息平台 T/CROPSSC 002 -2023 3 3.5 等位基因 allele 在同源染色体的同一基因座上的一对基因。 注：对于InDel 标记，等位基因差异以扩增产物片段大小或荧光信号类型不同来表示。 3.6 自交系位点纯合度 loci homogeneity of inbred line 反映自交系品种纯合稳定程度的参数。用纯合位点占总检测位点的百分率表示。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 bp：碱基对(base pair) 。 CTAB：十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethyl ammonium bromide) 。 DNA：脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid) 。 dNTPs：脱氧核苷三磷酸(deoxyribonucleoside triphosphates) 。 PAGE：聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis) 。 PCR：聚合酶链式反应(polymerase chain reaction) 。 SDS：十二烷基苯磺酸钠(sodium dodecyl sulfate) 。 InDel：插入缺失变异(Insertion -Deletion) 。 Taq酶：耐热 DNA聚合酶( Taq-DNA polymerase)。 CE：毛细管电泳( capillary electrophoresis )。 KASP：竞争性等位基因特异性 PCR (Kompetitive Allele Specific PCR) 5 原理 玉米的不同品种，其基因组存在着能够世代稳定遗传的插入缺失变异(InDel)带来的长度差异。通过 对检测样品进行 DNA提取、 PCR扩增和扩增产物电泳或荧光扫描发现差异，进而检测其扩增产物片段 大小或荧光类型不同而加以区分。 采用能够识别品种中杂株指纹或荧光信号的适宜引物，通过对待测 样品的杂株数目或百分率统计 进行纯度值测定，从而对其整体的典型一致程度做出评价。 6 检测方案 6.1 总则 6.1.1 引物、检测平台、样品状况不同，其检测结果准确度、精确度可能有所不同。应依据“ 适于检测 目的”的原则，统筹考虑检测规模和检测能力，择定适宜的引物、检测平台和 样品状况，制定相应的检 测方案。 6.1.2 在严格控制条件下，合成选择的引物，确定检测平台， 对检测样品按DNA 提取、 PCR扩增、电泳 或荧光扫描、数据分析的程序进行检测。 6.1.3 按规定要求填报检测结果，检验报告应注明所选择检测方案影响检测结果的关键信息。 6.1.4 品种纯度鉴定时，除待测样品外，一般应提供代表该品种的对照样品作为其正常个体的参考基因 型；如果待测样品为单交种，一般还应把其父母本样品基因型作为自交苗等异常个体的参考。 未提供对 全国团体标准信息平台 T/CROPSSC 002 -2023 4 照样品的，如果为匿名品种，可将待测样品的主要基因型作为参考基因型；如果为已知品种，必要时应 先将待测样品与已知品种标准样品或标准指纹比较，确定其真实性后再进行纯度鉴定。 6.2 引物 6.2.1 应明确所检测的杂株类型。 杂株的类型不同，所选引物和数目也有所不同， 必要时需相应父母本 的DNA指纹数据辅助判断杂株类型。杂交种的杂株类型主要为自交株、异交 株、混杂 株；自交系的杂 株类型主要为异交株、变异株、混杂株。 6.2.2 应通过 对待测样品进行预试验，筛选出能够准确识别该样品杂株的纯度鉴定引物。 引物筛选时还 需综合考虑引物的杂合度、DNA 快速提取和多重组合电泳的潜力。待测样品在个别引物位点存在遗传 不稳定状况时， 可将该引物剔除；待 测样品在多个引物位点存在严重遗传不稳定状况时， 可终止纯度鉴 定。 6.3 检测平台 6.3.1 基因型采集是纯度鉴定的关键环节，可采用电泳检测和荧光扫描两类平台对 InDel位点进行 基因 型采集。电泳检测可采用荧光毛细管电泳(CE) 或变性聚丙烯酰胺凝胶(PAGE) 电泳平台；荧光扫描检测 可采用 KASP荧光扫描平台。 6.3.2 样品量较大时，可将样品粉碎仪、 DNA自动提取和移液工作站、水浴 PCR扩增仪、多色荧光毛 细管电泳仪、KASP 荧光扫描平台进行组合，以提高检测的综合效率。 6.3.3 DNA 提取、 PCR扩增、电泳的技术条件要求， 可在适于检测目的和不影响检测质量的前提下作 适宜的修改。 6.4 样品 6.4.1 送验样品为种子， 对于杂交种样品重量应不低于 200 g或不少于 500粒；对于自交系样品重量应 不低于 400 g或不少于 1000粒。 6.4.2 从送验样品中随机分取规定数量的试样，试样的分取应符合 GB/T 3543.2 的要求。对于杂交种， 试样进行单粒独立检测，试样的数量应至少含有 96 (适用时可含对照) 粒种子；对于自交系，试样可采 用混合样或单粒独立检测，应至少含有 96 (适用时可含对照)×2 粒种子。 6.5 检测条件 应在有利于检测正确实施的控制条件下进行，包括但不限于下列条件： ——种子检验员具备熟悉所使用检测技术的知识和技能； ——所有仪器与使用的技术相适应，并已经过定期维护、验证和校准； ——使用适当等级的试剂和灭菌处理的耗材。 7 仪器设备、试剂和溶液配制 7.1 仪器设备 7.1.1 DNA 提取设备：高速冷冻离心机、水浴锅或金属浴、紫外分光光度计或核酸浓度测定仪、组织 研磨仪。 7.1.2 PCR 体系配制及扩增设备：移液器或移液工作站、PCR 扩增仪。 7.1.3 电泳设备 全国团体标准信息平台 T/CROPSSC 002 -2023 5 7.1.3.1 CE 电泳设备 ：DNA分析仪。 7.1.3.2 PAGE电泳设备 ：高压电泳仪、垂直电泳槽及制胶附件、水平摇床、