(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210533228.1 (22)申请日 2022.05.16 (71)申请人 浙江海洋大学 地址 316022 浙江省舟山市定海区临城街 道长峙岛海大南路1号 (72)发明人 杨天燕　黄新芯　韩志强　刘玉萍　 高天翔　 (74)专利代理 机构 浙江永航联科专利代理有限 公司 33304 专利代理师 侯兰玉 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 龙头鱼微 卫星DNA标记及其引物和应用 (57)摘要 本发明涉及一种龙头鱼微卫星DNA标记及其 引物和应用， 属于分子生物学DNA标记技术和遗 传学应用技术领域。 用于扩增龙头鱼微卫星DNA 标记位点的引物组合物， 所述的引物组合物是如 SEQ ID NO.1～SEQ  ID NO.52所示的核苷酸序 列。 本发明根据高通测序得到的数据， 开发出龙 头鱼微卫星DNA标记， 同时筛选出龙头鱼具有多 态性的微卫星标记引物， 解决了现有技术开发龙 头鱼微卫星分子标记效率低下的现状， 为今后进 一步开展遗传多样性研究和资源保护提供有利 工具。 权利要求书1页 说明书10页 序列表16页 附图1页 CN 114854877 A 2022.08.05 CN 114854877 A 1.龙头鱼微卫星DNA标记， 其特征在于： 龙头鱼微卫星DNA标记位点是如SEQ  ID NO.53 ～SEQ ID NO.78所示的核苷酸序列。 2.用于扩增龙头鱼微卫星DNA标记位点的引物 组合物， 其特征在于： 所述的引物组合物 是如SEQ ID NO.1～SEQ  ID NO.52所示的核苷酸序列。 3.龙头鱼微卫星DNA标记， 其特征在于： 龙头鱼微卫星DNA标记位点是如SEQ  ID NO.54、 SEQ ID NO.56、 SEQ  ID NO.66、 SEQ  ID NO.67、 SEQ  ID NO.68和SEQ  ID NO.69所示的核苷酸 序列。 6对引物(LTY ‑9、 LTY‑15、 LTY‑42、 LTY‑45、 LTY‑47和LTY‑58)。 4.用于扩增龙头鱼微卫星DNA标记位点的引物 组合物， 其特征在于： 所述的引物组合物 是如SEQ ID NO.3、 SEQ  ID NO.4、 SEQ  ID NO.7、 SEQ  ID NO.8、 SEQ  ID NO.27、 SEQ  ID  NO.28、 SEQ  ID NO.29、 SEQ  ID NO.30、 SEQ  ID NO.31、 SEQ  ID NO.32、 SEQ  ID NO.33、 SEQ  ID  NO.34所示的核苷酸序列。 5.一种龙头鱼遗传多样性分析试剂盒， 其特征在于： 包括权利要求2或4所述的引物组 合物。 6.权利要求2或4所述的引物组合物在龙头鱼群里遗传学分析中的应用。 7.一种权利要求6所述的应用， 其特 征在于， 包括如下步骤： S1、 龙头鱼基因 组DNA的提取； S2、 微卫星分子标记位点的PCR扩增： 在权利要求2所述的引物组合的正向引物5 ’端连 接荧光基团进 行修饰， 以龙头 鱼基因组DNA 为模板， 用修饰后的正向引物和对应的反向引物 进行PCR扩增； S3、 基因分型： 将扩增产物进行分型； S4、 遗传多样性分析。 8.根据权利要求7所述的应用， 其特征在于： S2中PCR扩增反应体系共25μl包括： 2.5μl   10×PCR缓冲液(Tran s， 北京)， 2 μl dNTPs， 正 反引物各 1 μl(10 μM)， 17.2 5 μl去离子 水， 0.25 μ l Easy Taq DNA聚合酶(Trans， 北京)和1 μl  DNA模板。 9.根据权利要求7所述的应用， 其特征在于： S2中PCR扩增程序设置为： 94℃预变性 5min、 94℃变性3 0s、 最佳退火温度下 退火30s、 72℃延伸3 0s、 循环3 3次， 72℃延伸10mi n。 10.根据权利要求7所述的应用， 其特征在于： S4所述的遗传多样性分析： 使用 GeneMarker读取基因分型结果文件， 经校正后读取最大峰值对应等位基因长度， 记录于 Excel表格中； 通过Excel  Microsatelite  Toolkit加载宏、 Convert和Genepop  v.4.0软件 实现文件类型转换； 利用Excel  Microsatelite  Toolkit计算各微卫星位点的遗传多样性 参数， 包括 等位基因数(A)、 观测杂合度(Ho)、 期望杂合度(He)和多态信息含量(PIC)。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114854877 A 2龙头鱼微卫星DNA标记及其引物和应用 技术领域 [0001]本发明涉及一种龙头鱼微卫星DNA 标记及其引物和应用， 属于分子生物学D NA标记 技术和遗传学应用技 术领域。 背景技术 [0002]龙头鱼(Harpadon  nehereus  Hamilton， 1822)又称豆腐鱼、 鼻涕鱼、 水潺。 隶属于 硬骨鱼纲(Osteichthyes)、 灯笼鱼目(Myctophiformes)龙头鱼科、 (Harpadontidae)、 龙头 鱼属(Harpadon)。 我国主要分布于黄海南部、 东海以及南海近岸或河口， 尤其喜欢栖息于泥 沙底质的环境中， 对温度和盐度的升降变化有较强的适应性。 龙头 鱼肉质细 嫩， 蛋白质含量 约达干重的70％， 钙磷含量高于大黄 鱼和带鱼等传统经济 鱼类， 营养价值丰富。 20世纪8 0年 代以来， 以龙头鱼为代表的中小型鱼类生物量在较短的时间呈迅速增加趋势， 逐渐成为了 东海和南海海区的优势种群， 甚至在浙江北部海域的主要生产季节龙头鱼在渔获物中所占 比例最高达75％， 经济地位和生态价值得到快速提升。 但近年来， 由于海洋生态环境破坏和 捕捞压力的增大， 舟山海域、 温台渔场、 闽江口渔场等海区龙头鱼群体呈现出低龄化、 小型 化趋势。 甚至被 “世界自然保护联盟濒危物种红色名录 ”(IUCN Red List of Threatened   Species， IUCN)列为近危种(Near  Threatene d， NT)， 龙头鱼资源的可持续开发利用应受到 更多的关注。 [0003]随着分子生物学技术的不断进步， 从遗传学角度提供物种保护和渔业资源恢复措 施， 已广泛的被科研人员和政府部门接受和采纳。 生物种群资源量的衰退常伴随着遗传多 样性水平的下降及遗传结构的改变。 对群体遗传背景的评估已成为保护生物学和生物种群 管理的主要目标之一。 评估工作的开展需要依托于有效的遗传标记。 微卫星标记 (Microsatellite)， 又称为短串联重复序列(Si mple tandem repeats， S TRs)或简单重复序 列(Simple  Sequence  Repeats， SSR)， 由含少数几个(1 ‑6个)碱基对的短串联重复DNA序列 组成。 微卫星标记凭借其丰富的多态性、 高度的杂合性、 低重组率、 共显性遗传、 庞大的数量 以及可重复性 等优点， 在群 体遗传学研究中被广泛应用。 [0004]传统的通过磁珠富集法构建微卫星文库， 已不能满足现代生物学研究的高效和低 成本需求。 近年来， 高通量测序技术的发展为动植物大规模微卫星标记的开发提供了组学 水平的全新策略。 转录组测序能快速获得特定组织或器官在某一阶段或功能状态下的在转 录本序列信息， 是获得与已知功能基因相连的微 卫星标记的方法 之一。 [0005]龙头鱼是我国沿海一种重要的经济鱼类， 也是近海海洋生态系统食物链中的重要 环节， 但由于海洋环境污染、 栖息地破坏、 过渡捕捞等状况 的相继加剧， 龙头鱼种质资源呈 衰退迹象， 亟需大力开展其种质资源的保护工作。 发明内容 [0006]本发明的目的在于提供一种龙头鱼微卫星DNA标记， 以利用其进行龙头鱼种质资 源保护和遗传多样性评估及分析。说　明　书 1/10 页 3 CN 114854877 A 3