(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210476485.6 (22)申请日 2022.04.29 (71)申请人 广西壮族自治区农业科 学院 地址 530007 广西壮 族自治区南宁市西乡 塘区大学东路174 号 (72)发明人 李战彪　莫翠萍　谢慧婷　崔丽贤　 陈锦清　林林　罗婉笛　李金哲　 蔡健和　秦碧霞　 (74)专利代理 机构 南宁颂博远信知识产权代理 事务所(普通 合伙) 45141 专利代理师 兰亚君 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01)C12R 1/94(2006.01) (54)发明名称 同步检测5种柑橘病毒的DPO RT-PCR引物 组、 检测方法、 试剂盒及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种同步检测5种柑橘病毒的 DPO RT‑PCR引物组、 检测方法、 试剂盒及其应用， 引物组的序列如SEQ  ID NO.1‑SEQ ID NO.10所 示。 本发明通过对柑橘衰退病毒、 柑橘碎叶病毒、 柑橘裂皮病毒、 柑橘黄化脉明病毒、 柑橘叶斑驳 病毒设计特异性DPORT ‑PCR引物， 检测引物可有 效去除引物 二聚体干扰， 可同时从样品中检测出 这5种病毒， 检测方法简便高效， 仅需要使用普通 PCR仪和电泳仪即可进行检测， 具有快速、 经济、 准确度高和灵敏度高的特点， 可用于田间柑橘植 株的大规模筛查和种苗调运前的防疫检测， 为健 康种苗检测及病害的田间筛查 提供了技 术支撑。 权利要求书1页 说明书5页 序列表3页 附图3页 CN 114790496 A 2022.07.26 CN 114790496 A 1.一种同步检测5种柑橘病毒的OPO  RT‑PCR引物组， 其特 征在于， 包括以下引物： 2条柑橘衰退病毒特异性引物： DPO‑CTV‑F： 5’ ‑TGGCTCGTAGACAC CIIIIICGTTCTCCGG‑3’， 如SEQ ID NO.1所示； DPO‑CTV‑R:5’ ‑CTAAGGAGAACTTCTTIIIIICACGCATACG ‑3’， 如SEQ ID NO.2所示； 2条柑橘碎叶病毒特异性引物： DPO‑CTLV‑F： 5’ ‑TGCTTCAACAAGCGAGGCIIIIICGGGTAGGAG‑3’， 如SEQ ID NO.3所示； DPO‑CTLV‑R:5’ ‑GTATAAAGGCAGGCATGTCAI IIIICAAGACCGCG‑3’， 如SEQ ID NO.4所示； 2条柑橘裂皮病毒的特异性引物： DPO‑CEV‑F:5’ ‑CGGGATCTTTCTTGAGIIIIIIGTGGTGCT‑3’， 如SEQ ID NO.5所示； DPO‑CEV‑R： 5’ ‑GCTCCTGTTTCTCCGCTGGIIIIIAGTGATC C‑3’， 如SEQ ID NO.6所示； 2条柑橘黄化脉明病毒特异性引物： DPO‑CYVCV‑F： 5’ ‑TCCATTGTCGACGAGTI IIIICTAAGCCAG‑3’， 如SEQ ID NO.7所示； DPO‑CYVCV‑R： 5’ ‑GGATAGCTGCG GTAGAGAG GGTIIIIGTAGTCGA AG‑3’， 如SEQ ID NO.8所示； 2条柑橘叶斑驳病毒的特异性引物， 具体如下： DPO‑CLBV‑F： 5’ ‑GGATTATGTGTCTCATGTI IIIIIAGAGACG G‑3’， 如SEQ ID NO.9所示； DPO‑CLBV‑R： 5’ ‑TGCAGCTTTGAGTGACI IIIICAATTCTTC‑3’， 如SEQ ID NO.10所示； 其中， I为次黄嘌呤。 2.一种检测试剂 或试剂盒， 其特征在于， 所述检测试剂 或试剂盒包含权利要求1所述的 OPO RT‑PCR引物组。 3.一种同步检测柑橘衰退病毒、 柑橘碎叶病毒、 柑橘裂皮病毒、 柑橘黄化脉明病毒、 柑 橘叶斑驳病毒的方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： (1)取待测样品， 提取其总RNA， 反转录为cDNA； (2)采用权利要求1所述的OPO  RT‑PCR引物组， 以待测样品的cDNA为模板进行PCR反应， 获得扩增产物； (3)使用琼脂糖电泳检测 PCR扩增产物： 如扩增到416bp 大小的条带， 表明样品中含有柑 橘衰退病毒； 如扩增到716bp大小的条带， 表明样品中含有柑橘碎叶病毒； 如扩增到187bp大 小的条带， 表明样品中含有柑橘 裂皮病毒； 如扩增 到938bp大小的条带， 表明样品中含有柑 橘黄化脉明病毒； 如扩增到 576bp大小的条 带， 表明样品中含有柑橘叶斑驳病毒。 4.按照权利要求3所述的方法， 其特征在于， 所述PCR反应的反应体系为20 μL， 各引物的 浓度为： 引物DPO ‑CTV‑F和引物DPO ‑CTV‑R的浓度均为0.2 μM， 引物DPO ‑CTLV‑F和引物DPO ‑ CTLV‑R的浓度均为0.1μM， 引物DPO ‑CEV‑F和引物DPO ‑CEV‑R的浓度均为0.5μM， 引物DPO ‑ CYVCV‑F和引物DPO ‑CYVCV‑R的浓度均为0.3 μM， 引物DP O‑CLBV‑F和引物DPO ‑CLBV‑R的浓度 均为0.3 μM 。 5.按照权利要求4所述的方法， 其特征在于， 所述PCR反应的反应程序 为： 50℃30min， 94 ℃5min； 30个循环参数为： 94℃变性3 0s， 56℃退火3 0s， 72℃延伸2mi n； 最后72℃延伸10mi n。 6.权利要求1所述的OP O RT‑PCR引物组在同步检测柑橘衰退病毒、 柑橘碎叶病毒、 柑橘 裂皮病毒、 柑橘黄化脉明病毒、 柑橘叶斑驳病毒中的应用。 7.权利要求2所述的检测试剂 或试剂盒在同步检测柑橘衰退病 毒、 柑橘碎叶病毒、 柑橘 裂皮病毒、 柑橘黄化脉明病毒、 柑橘叶斑驳病毒中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114790496 A 2同步检测5种柑橘病毒 的DPO RT‑PCR引物组、 检测方 法、 试剂 盒及其应用 技术领域 [0001]本发明属于植物病毒检测技术领域， 具体涉及一种同步检测5种柑橘病毒的DPO RT‑PCR引物组、 检测方法、 试剂盒及其应用。 背景技术 [0002]随着柑橘种植面积不断扩大和新品种引进种植， 区域间种苗调运频繁； 由于难于 监管， 导致多种病虫害通过种苗携带传播流行， 并造成严重危害， 其中， 病毒病害尤其突 出。 [0003]柑橘衰退病毒(Citrus  tristezavirus,CTV)引起柑橘树势衰退、 枝条茎陷点、 果 实变 小等症状； 柑橘碎叶病毒(Citrus  tatter leafvirus,CTLV)引起植株黄化衰弱， 严重 时整株 枯死； 柑橘裂皮病 毒(Citrus  exocortis  viroid， CEVd)的病树矮化， 新梢少而弱， 叶片小 且多数呈缺锌症状， 病树开花多， 但落花落果严重， 产量低； 柑橘黄化脉明病毒 (Citrus yellow vein  clearing  virus， CYVCV)能感染柠檬、 酸橙、 甜橙等大多数柑橘种 类， 会引起不同程  度的脉明、 褪绿和花叶症状， 在砂糖橘上会造成严重的叶卷； 柑橘叶斑驳 病毒(Citrus  leaf blotchvirus， CLBV)侵染柑橘属植物后， 可引起枳橙或柚子作为砧木上 的接穗异常结合，  柑橘的接穗与 砧木的不亲和性会直接危害柑橘树的生长， 进而造成柑橘 产业重大的经济损  失。 上述5种柑橘病毒是较为常见的侵染柑橘的RNA病毒， 可经介体蚜 虫、 接穗进 行传 播， 而带毒苗木的大范围调运则增加了病毒病远距离传播的风险， 因此， 建 立高效、 特异、  灵敏度高的病毒检测方法有利于防止柑橘病毒随苗木传播的风险， 从源头 控制该类病害。 [0004]双启动寡核苷 酸引物(dual ‑primering oligonucleot ide， DPO)是一种新型的P CR 引物 设计方法， 具有 特异性高， 引物设计简单等优点。 目前已广泛应用于多种病原菌、 病毒 病 原的检测中。 [0005]公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解， 而不应 当被 视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技 术。 发明内容 [0006]本发明针对现有技术中存在的技术问题， 提供同步检测5种柑橘病毒的DPO  RT‑ PCR 引物组、 检测方法、 试剂盒及其应用。 [0007]为实现上述目的， 本发明提供的技 术方案如下： [0008]一种同步检测5种柑橘病毒的OPO  RT‑PCR引物组， 包括2条柑橘衰退病毒(CTV)  特 异性引物， 2条柑橘碎叶病毒(CTLV)特异性引物， 2条柑橘裂皮病毒(CEVd)的特  异性引物， 2 条柑橘黄化脉明病毒(CYVCV)特异性引物， 2条柑橘叶斑驳病毒(CLBV)  的特异性引物， 具体 如下：说　明　书 1/5 页 3 CN 114790496 A 3