(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210458248.7 (22)申请日 2022.04.28 (71)申请人 湖北省农业科 学院果树茶叶研究所 地址 430064 湖北省武汉市洪山区南湖大 道10号 (72)发明人 马小方　皮特·莫菲　周益军　 将迎春　吴黎明　王志静　何利刚　 宋放　 (74)专利代理 机构 成都东唐智 宏专利代理事务 所(普通合伙) 51261 专利代理师 晏辉 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/6806(2018.01)C12Q 1/6816(2018.01) C12R 1/94(2006.01) (54)发明名称 一种基于Northern杂交检测番茄黄化曲叶 病毒的方法 (57)摘要 本发明涉及植物病毒检测技术领域， 尤其涉 及一种基于Northern杂交检测番茄黄化曲叶病 毒的方法。 包括以下步骤： 步骤1.根据番茄黄化 曲叶病毒基因组序列设计引 物C4‑F和C4‑R， PCR 法制备带地高辛标记的番茄黄化曲叶病毒特异 性DNA探针； 步骤2.感染番茄黄化曲叶病毒3天后 的烟草总RNA提取和总RNA在琼脂糖胶上的分离； 步骤3.虹吸法转移步骤2中分离的总RNA至带正 电的尼龙膜， 转膜结束后 在紫外交联仪下固定膜 上的总RNA； 步骤4.预杂交， 并使用步骤1中制备 的探针进行杂交； 步骤5.洗涤杂交膜及杂交信号 检测。 该方法克服了现有检测技术的缺点， 提供 了一种灵敏、 特异检测番茄黄化曲叶病毒的方 法。 权利要求书2页 说明书6页 附图1页 CN 114875177 A 2022.08.09 CN 114875177 A 1.一种基于N orthern杂交检测番 茄黄化曲叶病毒的方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： S1.根据番 茄黄化曲叶病毒基因 组序列设计引物C4 ‑F和C4‑R； 通过PCR法制备 带地高辛标记的番 茄黄化曲叶病毒特异性DNA探针； S2.提取感染番 茄黄化曲叶病毒3天后的烟草总RNA； 在琼脂糖胶上的分离总RNA； S3.采用虹吸法转移S2中分离的总RNA至带正电的尼龙膜； 转膜结束后在紫外交联仪下固定膜上的总RNA； S4.预杂交， 并使用步骤S1中制备的特异性DNA探针进行杂交； S5.洗涤杂交膜； 进行杂交信号检测。 2.根据权利要求1所述的一种基于Northern杂交检测番茄黄化曲叶病毒 的方法， 其特 征在于， 所述C4 ‑F引物序列为： 5 ’ ‑ATGGGGAACCACATCTC C‑3’； 所述C4‑R引物序列为： 5 ’ ‑TTAATATATTGAGGGCCTCGG‑3’。 3.根据权利要求1所述的一种基于Northern杂交检测番茄黄化曲叶病毒 的方法， 其特 征在于， 所述S2中， 提取感染番 茄黄化曲叶病毒3天后的烟草总RNA， 包括以下步骤： 用液氮迅速研磨烟草组织成细粉状； 在1.5ml Eppendorf管中加入0.05～0.10g研磨后的粉末， 加入1ml  Trizol提取缓冲 液， 室温混匀后加入20 0 μl氯仿， 剧烈振荡后于室温静置 5min； 于4℃、 120 00r/min条件下， 离心15mi n； 吸上清液至新的1.5ml  EP管中， 加入等体积的异丙醇， 于4℃沉淀1h； 于4℃、 120 00r/min条件下， 离心15mi n； 舍弃上清液， 进行瞬时离心， 用枪头吸尽残留液体， 加入700 μl75 ％预冷乙醇洗涤沉淀， 用枪头吸打沉淀； 于4℃、 5000r/min条件下， 离心5mi n， 弃乙醇后重复一次； 将超净工作台上吹干， 加入5 0 μlDEPC处 理的去离 子水， 于‑20℃保存备用。 4.根据权利要求1所述的一种基于Northern杂交检测番茄黄化曲叶病毒 的方法， 其特 征在于， 所述S2中， 在琼脂糖胶上的分离总RNA， 包括以下步骤： S21.制备1.0％(w/v)琼脂糖凝胶： 将1.2g琼脂糖和11ml  10×MOPS+99ml DEPC处理去离子水， 获得混合液， 将该混合液微 波炉加热熔解琼脂糖后置于通风厨冷却至50 ‑60℃； 加入10ml 37％甲醛以及适量10mg/ml 溴化乙锭， 混匀后 倒胶； S22.将4倍体积的总RNA与1倍体积的5 ×RNA loading buffer混匀后， 65℃水浴变性 10min后， 冰浴3 ‑5min， 瞬时离心后点样； S23.点样后， 以5 ‑7V/cm的电压在1 ×MOPS电泳缓冲液中跑胶1.5 ‑2.5h。 5.根据权利要求1所述的一种基于Northern杂交检测番茄黄化曲叶病毒 的方法， 其特 征在于， S3包括以下步骤： 将胶置于适量体积的20 ×SSC中洗涤两次， 每次15min； 然后采用DEPC处理过的水洗涤 10min； 洗涤结束后， 将胶置于事先搭好的盐桥正中心， 切去胶周围凸出的部分； 处理完胶后在权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114875177 A 2胶上覆盖合适区域的尼龙膜， 赶走胶与膜之间的气泡， 在尼龙膜上覆盖3 ‑5层与胶面积大小 相同的3mm滤纸， 滤纸上方放置一叠Paper  Tower， Paper  Tower上面再放一块大小 合适的玻 璃， 最后玻璃上 方放置适当重量的重物， 转膜装置固定好之后开始转膜； 转膜时间12 ‑20h， 转膜缓冲液为20 ×SSC； 转膜结束后在紫外交联仪下固定膜上的总RNA， 固定条件： 1.5J/ cm2105 s。 6.根据权利要求1所述的一种基于Northern杂交检测番茄黄化曲叶病毒 的方法， 其特 征在于， S4包括以下步骤： 将杂交液在50℃杂交箱中预热， 预热后将上述备好的尼龙膜置于其中， 预杂交2 ‑6小 时， 制得预杂交液； 将S1中制得的特异性DNA探针在95℃变性10min后， 取5 μl加入上述预杂交液中， 混匀后 在50℃杂交箱中杂交， 杂交时间： 16 ‑20h。 7.根据权利要求1所述的一种基于Northern杂交检测番茄黄化曲叶病毒 的方法， 其特 征在于， S5中， 洗涤杂交膜， 包括： 高盐洗涤： 在含有0.1％S DS的2×SSC溶液中室温洗涤 2次， 每次5mi n； 低盐洗涤： 在含有0.1％S DS的0.1×SSC溶液中50℃洗涤2次， 每次15mi n； 洗涤液洗涤： 1 ×Washing buffer室温洗涤杂交膜5mi n； 封闭液封闭： 1 ×Blockingbuffer室温封闭杂交膜3 0min； 抗体孵育： 抗体Anti ‑Digoxigenin ‑AP和1×Blocking  buffer按照1:20,000稀释， 室温 孵育杂交膜3 0min； 洗涤液洗涤： 1 ×Washing buffer室温洗涤杂交膜 2次， 每次15mi n。 8.根据权利要求1所述的一种基于Northern杂交检测番茄黄化曲叶病毒 的方法， 其特 征在于， S5中， 进行杂交信号检测， 包括： 将杂交膜在1 ×Detection  buffer中孵育2 ‑3min后使用试剂盒CDP ‑Starready ‑to‑use 进行杂交信号显色。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114875177 A 3