(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210460154.3 (22)申请日 2022.04.28 (71)申请人 广东省农业科 学院动物卫 生研究所 地址 510640 广东省广州市天河区五山白 石岗21号 (72)发明人 翟颀　吕殿红　赵亮　孙铭飞　 罗胜军　温肖会　贾春玲　周秀蓉　 (74)专利代理 机构 西安方诺专利代理事务所 (普通合伙) 61285 专利代理师 景丽娜 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种引物探针组及其应用和一种检测非洲 猪瘟病毒、 猪瘟病毒、 猪丹 毒丝菌的试剂盒 (57)摘要 本发明提供了一种引物探针组及其应用和 一种检测非洲猪瘟病毒、 猪瘟病毒、 猪丹毒丝菌 的试剂盒。 本发 明提供的试剂盒同时含有非洲猪 瘟病毒、 猪瘟病毒、 猪丹毒丝菌的引物探针组， 6 条引物及3条探针同时加入到一个反应体系中， 且互不干扰， 使用本发明的试剂盒检测非洲猪瘟 病毒、 猪瘟病毒、 猪丹毒丝菌时， 一次扩增反应可 完成三种病原筛查。 对非洲猪瘟病毒、 猪丹毒丝 菌、 猪瘟病毒的最低检测限均为24.9copies/μ L， 具有很好的灵敏性， 而且具有良好的特异性， 稳定性好， 且操作简便 。 权利要求书1页 说明书6页 序列表3页 附图3页 CN 114752707 A 2022.07.15 CN 114752707 A 1.一种引物探针组， 其特征在于， 包括用于对非洲猪瘟病毒、 猪瘟病毒、 猪丹毒丝菌进 行鉴别的探针组合物， 其中靶标探针包括： 针对非洲猪瘟病毒P72基因的探针ASFV ‑P， 其序列如SEQ  ID NO.3所示， 针对猪瘟病毒5 ’ ‑UTR区域的探针CSFV ‑P， 其序列如SEQ  ID NO.6所示， 针对猪丹毒丝 菌16s rRNA基因的探针Er ‑P， 其序列如SEQ  ID NO.9所示， 还包括用于对对非洲猪瘟病 毒、 猪瘟病毒、 猪丹毒丝菌进行鉴别时所使用的扩增引物， 其包括： 针对非洲猪瘟病毒P72基因设计引物对， 其引物对由SEQ  ID NO.1所示的引物和SEQ  ID  NO.2所示的引物组成； 针对猪瘟病毒5 ’ ‑UTR区域设计引物对， 其引物对由SEQ  ID NO.4所示的引物和SEQ  ID  NO.5所示的引物组成； 针对猪丹毒丝菌16s  rRNA基因设计引物对， 其引物对由SEQ  ID NO.7所示的引物和SEQ   ID NO.8所示的引物组成。 2.根据权利要求1所述的一种引物探针组， 其特征在于， 所述的针对非洲猪瘟病毒P72 基因的探针ASFV ‑P的5'端连接有荧光报告基团6 ‑FAM， 3'端 连接有荧光淬灭基团BHQ1； 所述 针对猪瘟病毒5 ’ ‑UTR区域的探针CSFV ‑P的5'端连接有荧光报告基团ROX， 3'端连接有荧光 淬灭基团BHQ2； 所述针猪丹毒丝菌16srRNA基因的探针Er ‑P的5'端连接有荧光报告基团 VIC， 3'端连接有荧 光淬灭基团BHQ2。 3.权利要求1～2任一项所述的引物探针组在制备检测非洲猪瘟病毒、 猪瘟病毒、 猪丹 毒丝菌的试剂盒中的应用。 4.一种基于三重荧光PCR同时检测非洲猪瘟病毒、 猪瘟病毒、 猪丹毒丝菌的试剂盒， 其 特征在于， 所述试剂盒包括权利要求1～ 2任一项所述的引物探针组。 5.根据权利要求4所述的一种基于三重荧光PCR同时检测非洲猪瘟病毒、 猪瘟病毒、 猪 丹毒丝菌的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒还包括阳性标准品、 阴性标准品、 One  Step  RT‑qRT‑PCR Mix以及DEPC水。 6.根据权利要求5所述的一种基于三重荧光PCR同时检测非洲猪瘟病毒、 猪瘟病毒、 猪 丹毒丝菌的试剂盒， 其特征在于， 所述阳性标准品为将SEQ  ID NO.10、 SEQ  ID NO.11和SEQ   ID NO.12所示的序列依次连接后克隆至pUC57载体经测序鉴定， 得到的重组载体pUC57/ ASFV‑CSFV‑Er； 所述阴性标准品为 生理盐水。 7.根据权利要求5所述的一种基于三重荧光PCR同时检测非洲猪瘟病毒、 猪瘟病毒、 猪 丹毒丝菌的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒中ASFV ‑F、 ASFV‑R与ASFV‑P各组分均为0.2 μL， 工作浓度为100nM； CSFV ‑F、 CSFV‑R与CSFV‑P各组分均为0.15 μL， 工作浓度为75nM； Er ‑F、 Er‑ R与Er‑P各组分均为0.15 μL， 工作浓度为75nM； 所述三重荧光PCR扩增的反应程序为： 52℃反 转录5min； 95℃预变性10s； 95℃变性5s， 54℃退火延伸30s， 45个循环， 在每一循环退火结束 时收集荧光信号。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114752707 A 2一种引物探针组及其应用和一种检测非洲猪瘟病毒 、 猪瘟病 毒、 猪丹毒丝菌的试剂盒 技术领域 [0001]本发明属于分子生物学检验的技术领域， 具体涉及一种引物探针 组及其应用和一 种检测非洲猪瘟病毒、 猪瘟病毒、 猪丹毒丝 菌的试剂盒。 背景技术 [0002]非洲猪瘟(Afr ican swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(Afr ican swine fever virus,ASFV)引起的猪的一种急性、 热性、 高度接触性动物传染病， 我国将其列为一类动物 疫病。 ASF是养猪业的头号杀手， 如何对ASF进 行科学防控 是当前养猪业的重点和难点。 由于 ASF的发病临床症状和病理变化与其他猪传染病很相 似， 特别是猪瘟(CSF)、 猪丹毒丝菌病 (Erysipelot hrixr husiopat hiae)和猪高致病性蓝 耳病(PRRS)， 均有发热、 出血、 皮肤发红 和脾脏肿大等症状， 从临床表现和病理变化难以区分， 需要依据实验室诊断才能定性。 因此 建立一种对疑似发病猪进行ASFV、 CSFV和E.rhusiopathiae鉴别诊断的检测方法具有重要 意义。 [0003]聚合酶链式反应(Polymerase  chain reaction,PCR)技术已广泛应用于ASFV的诊 断检测， OIE 《陆生动物诊断试验和疫苗手册》 推荐的ASFV检测方法主要是传统PCR和实时荧 光PCR。 然而传统PCR 需要进行凝胶电泳分析， 操作繁琐， 且灵敏度相对较低； 实时荧光P CR的 灵敏度和试验速度较传统P CR大大提升， 并且 可以同时特异 性检测多种病原。 因此运用荧光 PCR建立能够区分ASFV、 CSFV和E.  rhusiopat hiae的精确鉴别检测方法， 可为ASFV的防控和 净化提供新的技 术保障。 发明内容 [0004]针对上述问题， 本发明提出一种引 物探针组及其应用和一种检测非洲猪瘟病毒、 猪瘟病毒、 猪丹毒丝菌的试剂盒， 该试剂盒能够对疑似发病猪进行ASFV、 CSFV  和 E.rhusiopathiae鉴别诊断。 [0005]本发明采用的技 术方案为： [0006]一种引物探针 组， 包括用于对非洲猪瘟病毒、 猪瘟病毒、 猪丹毒丝菌进行鉴别的探 针组合物， 其中靶标探针包括： [0007]针对非洲猪瘟病毒P72基因的探针ASFV ‑P， 其序列如SEQ  ID NO.3所示， [0008]针对猪瘟病毒5 ’ ‑UTR区域的探针CSFV ‑P， 其序列如SEQ  ID NO.6所示， [0009]针对猪丹毒丝 菌16s rRNA基因的探针Er ‑P， 其序列如SEQ  ID NO.9所示， [0010]还包括用于对对非洲猪瘟病毒、 猪瘟病毒、 猪丹毒丝菌进行鉴别时所使用的扩增 引物， 其包括： [0011]针对非洲猪瘟病毒P72基因设计引物对， 其引物对由SEQ  ID NO.1所示的引物和 SEQ ID NO.2所示的引物组成； [0012]针对猪瘟病毒5 ’ ‑UTR区域设计引物对， 其引物对由SEQ  ID NO.4所示的引物和SEQ  说　明　书 1/6 页 3 CN 114752707 A 3