(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 20221045151 1.X (22)申请日 2022.04.27 (71)申请人 江苏华熙益能生物科技有限公司 地址 214028 江苏省无锡市新吴区菱湖大 道99-2号303 申请人 北京华熙荣熙生物技 术研究有限公 司　 华熙生物科技股份有限公司 (72)发明人 张伟平　张晨　高萌　张天萌　 王瑞妍　 (74)专利代理 机构 北京唐颂永信知识产权代理 有限公司 1 1755 专利代理师 刘伟 (51)Int.Cl. C12N 15/10(2006.01)C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 多聚脱氧核糖核苷酸及其制备方法 (57)摘要 本申请提供一种多聚脱氧核糖核苷酸的制 备方法， 所述制备方法包括以下步骤： 获取鲑鱼 基因组DNA， 采用多重置 换扩增鲑鱼基因组DNA制 备得到经扩增的鲑鱼DNA片段， 将所述鲑鱼DNA片 段打断， 得到多聚脱氧核糖核苷酸。 本申请还提 供一种多聚脱氧核糖核苷酸， 所述多聚脱氧核糖 核苷酸中长度小于等于400bp的片段占比大于 90％， 大于等于1000bp的片段占比小于2％。 本申 请提供的方法通过合成生物学技术， 仅需引入少 量外源蛋白(Phi  DNA聚合酶)， 即可大量合成鲑 鱼精DNA。 此外， 本申请合成的鲑鱼精DNA不是全 长的基因组DNA(genome  DNA,gDNA)而是片段大 小处在12kb～100kb的长片段DNA； 通过复合物理 破碎方法和生物处理手段， 可在短时间内获取大 量分子量大小理想的P DRN样品。 权利要求书1页 说明书8页 附图2页 CN 115109775 A 2022.09.27 CN 115109775 A 1.一种多聚脱氧核糖核苷酸的制备 方法， 其特 征在于， 所述制备 方法包括以下步骤： 获取鲑鱼基因 组DNA， 采用多重 置换扩增鲑鱼基因 组DNA制备 得到经扩增的鲑鱼DNA片段， 将所述鲑鱼DNA片段打断， 得到多聚脱氧核糖核苷酸。 2.根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于， 所述采用多重置换扩增鲑鱼基因组 DNA制备得到经扩增的鲑鱼DNA片段包括以下步骤： 对获得的鲑鱼基因 组DNA进行处 理以获得 单链的鲑鱼基因 组DNA模板， 中和处理所述模板， 将随机引物在包含经中和处理的模板、 Phi29  DNA聚合酶、 dNTP的PCR体系中进行多重 置换扩增， 对Phi29 DNA聚合酶进行灭活， 得到所述经扩增的鲑鱼DNA片段。 3.根据权利要求2所述的制备方法， 其特征在于， 所述随机引物在PCR体系中的浓度为 0.2‑1.0 μM。 4.根据权利要求2所述的制备 方法， 其特 征在于， 多重 置换扩增的时间为2 ‑4h。 5.根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于， 所述打断包括超声处理和/或酶切 处 理， 优选地， 所述打断包括首 先进行超声处 理， 然后进行酶切处 理。 6.根据权利要求5所述的制备方法， 其特征在于， 所述超声处理的超声功率为200 ‑ 400W、 占空比为1:0.5 ‑2， 超声处 理时间为10 ‑60min。 7.根据权利要求5所述的制备方法， 其特征在于， 所述酶切处理使用浓度为50 ‑100U/ml 的限制性内切酶Sau  3AI在37‑40℃恒温处 理1‑2h。 8.根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于， 所述制备方法还包括将所述鲑鱼DNA 片段打断之后去除蛋白、 沉淀得到 鲑鱼DNA片段的步骤。 9.一种多聚脱氧核糖核苷酸， 其特征在于， 所述多聚脱氧核糖核苷酸中长度小于等于 400bp的片段占比大于80％， 优选大于90％， 进一步优选长度小于等于20 0bp的片段占比大于40％， 优选大于 50％， 进一步优选长度小于等于 600bp的片段占比大于90％， 优选大于95％， 进一步优选长度大于等于10 00bp的片段占比小于10％， 优选小于2％。 10.根据权利要求9所述的多聚脱氧核糖核苷酸， 其特征在于， 所述多聚脱氧核糖核苷 酸通过权利要求1 ‑8中任一项所述的制备 方法制得。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115109775 A 2多聚脱氧核糖核 苷酸及其制备方 法 技术领域 [0001]本申请属于生物工程领域， 具体地， 涉及一种多聚脱氧核糖核苷酸及其制备 方法。 背景技术 [0002]多聚脱氧核糖核苷酸(Polydeoxyribonucleotide,PDRN)是源自鲑 鱼、 鳟鱼或大马 哈鱼等精巢或精液中的一类天然生物活性物质， 其本质是一种分子量大小处在50～1, 500KDa的脱氧核糖核苷酸结合体。 由于鲑 鱼基因组在碱基结构和构成比例上与人类基因组 的高度相似性(≥95％)， 因此经过严格处理纯化后的PDRN不存在免疫原性且具有高度的安 全性和稳定性。 体外和体内实验表明， 细胞表面的腺苷A2A受体通过识别腺苷受体激动剂 PDRN， 可以起到调节炎症、 降低细胞耗氧量、 改善组织局部缺血、 促进细胞生长和血管生成 的作用。 此外， PDRN通过参与 “补救合成途径”可以为细胞生长提供核苷和核苷 酸， 延长细胞 寿命， 改善细胞状态。 总之， PDRN作为一种新的功能性原料具有组织修复、 促进伤口愈合以 及延缓衰老等作用， 目前已经被广泛应用于医药、 化妆品、 食品和保健品等领域。 [0003]富含DNA的鱼类精巢和精液是提取PDRN的理想原料。 然而， 受到石油泄漏、 核废水 排放以及船舶污染等带来的重金属超标、 基因突变和染色体畸变等意料之外的风险， 通过 鲑鱼精巢或精液直接提取PDRN不再作为最佳选择。 此外， 深海鲑鱼种群作为一种生态系统 的重要组成部 分， 现代渔业捕捞很容易导致海洋生态系统退化、 种群灭绝等风险。 21世纪是 生物技术大爆发的时代， 其中合成生物学通过工程化的策略， 可以有目的地设计合成标准 化的生物元件， 构建特定的基因回路， 组装具有 特定功能的人工生命系统， 从而定向地人工 合成多种原料、 药物和生物能源等等。 多PDRN的生产过程主要分为DNA提取和DNA打断两大 工艺步骤， 其中现有的工业DNA提取方法包括醇沉法、 盐析法和柱层析法等， DNA打断方法有 物理破碎法(超声破碎)和生物破碎法(酶切处理)等。 例如专利CN107287186A公开的一种从 鱼类的精液分离多脱氧核糖核苷酸的方法通过盐析法纯化鲑鱼DNA并通过物理破碎法获取 PDRN； 专利CN106031709B(辉文授权)公开的一种鱼精DNA ‑NA、 鱼精蛋白提取物及其制备方 法使用柱层析法获取高浓度的鱼精DNA ‑NA提取物； 专利CN112315836A公开的一种高效的外 用PDRN的制备方法通过醇沉法获取高纯度DNA再经由限制性内切酶处理获取高质量PDRN。 由于是从动物细胞中直接提取DNA， 工业DNA提取工艺很容易造成大量蛋白残留。 PDRN生产 过程中单一的打断处理不仅具备功耗大、 成本高和反应时间长的缺点， 而且并不总能获取 理想的分子量大小。 例如专利CN107287186A未测量样品中蛋白残留量且缺乏关键性证据表 征分子量大小及分布区间； 专利CN106031709B获得的DNA样品中蛋白残留量为2.5～5％且 并未提及分子量大小及分布区间； 专利CN112315836A虽然 蛋白残留量低于1％且PDRN分布 范围较为理想， 但是在DNA打断过程使用单一 酶切处理(37℃恒温孵育16h)不仅成本高昂而 且反应时间较长 。 发明内容 [0004]针对现有技 术存在的问题， 本申请提供一种多聚脱氧核糖核苷酸及其制备 方法。说　明　书 1/8 页 3 CN 115109775 A 3