(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210444745.1 (22)申请日 2022.04.26 (71)申请人 南京合谷生命生物科技有限公司 地址 210000 江苏省南京市江北新区新锦 湖路3-1号中丹园A栋1 105室 (72)发明人 华夏　丁叶　李亚　 (74)专利代理 机构 南京聚匠知识产权代理有限 公司 323 39 专利代理师 沈菊 (51)Int.Cl. C12N 1/21(2006.01) C12N 15/70(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12P 7/62(2022.01) C12R 1/19(2006.01) (54)发明名称 一种生物合成原儿茶酸甲酯的菌 株及应用 (57)摘要 本发明公开了一种生物合成原儿茶酸甲酯 的菌株及应用， 该生物合 成原儿茶酸甲酯的菌株 是KPHS基因片段与线性化表达质粒载体连接环 化的质粒pHG10转化导入大肠杆菌感受态细胞筛 选而成， 该生物合成原儿茶酸甲酯的菌株生物催 化对羟基苯甲酸甲酯合成原儿茶酸甲酯。 本发明 生物合成原儿茶酸甲酯的菌株作为催 化剂， 以生 物合成的方式获得原儿茶酸甲酯， 能够减少化学 试剂的使用量， 降低对人体的毒 害性。 权利要求书2页 说明书5页 序列表11页 附图2页 CN 114606174 A 2022.06.10 CN 114606174 A 1.一种生物合成原儿茶酸甲酯的菌株， 其特征在于， 该生物合成原儿茶酸甲酯的菌株 是KPHS基因片段与线性化表达质粒载体连接环 化的质粒pH G10转化导入 大肠杆菌感受态细 胞筛选而成； 所述KPHS基因片段 是含有KPHS基因的质粒 经扩增获得； 所述线性 化表达质粒 载体是表达质粒 经反向扩增、 消化获得。 2.根据权利要求1所述的一种生物合成原儿茶酸甲酯的菌株， 其特征在于， 所述表达质 粒为pet2 0b、 pET28a或pThioHi sA的一种； pet2 0b的核苷酸序列为SEQ  ID No.5所示， pET28a 的核苷酸序列为SEQ  ID No.6所示， pThi oHisA的核苷酸序列为SEQ  ID No.7所示。 3.根据权利要求1所述的一种生物合成原儿茶酸甲酯的菌株， 其特征在于， 所述KPHS基 因的核苷酸序列为SEQ  ID No.1~SEQ ID No.14所示的任一序列。 4.根据权利要求1所述的一种生物合成原儿茶酸甲酯的菌株， 其特征在于， 所述大肠杆 菌感受态细胞为大肠杆菌BL21、 大肠杆菌BW25113、 大肠杆菌W3110或大肠杆菌MG1655的一 种。 5.根据权利要求1至权利要求4任一所述的生物合成原儿茶酸甲酯的菌株， 其特征在 于， 所述生物合成原儿茶酸甲酯的菌株的构建方法， 包括以下步骤： S1、 环形质粒pHG10构建 S1.1、 KPHS基 因片段： 以含有KPHS基 因的质粒为模板， 通过引物KPHS ‑F/KPHS‑R进行PCR 扩增， 获得 KPHS基因片段； S1.2、 线性化表达质粒载体： 以表达质粒为模板， 通过引 物质粒‑F/质粒‑R进行反向扩 增， 得到PCR产物， 经 过纯化、 I消化， 获得线性 化表达质粒 载体； S1.3、 环形质粒pHG10： 将上述的KPHS基因片段和上述的线性化表达质粒载体进行连接 环化， 获得环形质粒pHG10； S2、 重组菌株sHG10构建 S2.1、 复苏培养： 将0.2~5 μl质粒pHG10以化学转化法导入50 μl大肠杆菌感受态细胞 中， 冰浴30min后于42℃水浴中热激60s进行热休克处理， 再进行冰浴2min， 接着再加入1mL的LB 液体培养基， 在37℃下培 养1h， 获得复苏细胞 液； S2.2、 平板培养： 将复苏细 胞液涂布在LB琼脂糖平板上， 在37℃下过夜培养， 长出菌落， 通过菌落PCR筛 选阳性克隆， 获得重组菌株sHG10， 即生物合成原儿茶酸甲酯的菌株； LB液体培养基的配方： 每升培养基， 胰蛋白胨10g， 酵母提取物5g， NaCl  10g， 其余纯水； LB琼脂糖平板的配方： 每升培养基， 胰蛋 白胨10g， 酵母提取物5g， NaCl  10g， 琼脂10g， 其余 纯水。 6.根据权利要求5所述的一种生物合成原儿茶酸甲酯的菌株， 其特征在于， 所述引物 KPHS‑F/KPHS‑R中： KPHS ‑F的核苷酸序列为SEQ  ID No.8所示， KPHS ‑R的核苷酸序列为SEQ   ID No.9所示。 7.根据权利要求5所述的一种生物合成原儿茶酸甲酯的菌株， 其特征在于， 表达质粒为 pet20b时， 质粒 ‑F/质粒‑R为pet20b ‑F/pet20b ‑R， 则pet20b ‑F的核苷酸序列为SEQ  ID  No.10所示， pet 20b‑R的核苷酸序列为SEQ  ID No.11所示； 表达质粒为pET28a时， 质粒 ‑F/质粒‑R为pET28a ‑F/pET28a ‑R， 则pET28a ‑F的核苷酸序 列为SEQ ID No.12所示， pET28a ‑R的核苷酸序列为SEQ  ID No.13所示； 表达质粒为pThioHisA时， 质粒 ‑F/质粒‑R为pThioHisA ‑F/pThioHisA ‑R， 则pThioHisA ‑权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114606174 A 2F的核苷酸序列为SEQ  ID No.14所示， pThi oHisA‑R的核苷酸序列为SEQ  ID No.15所示。 8.一种权利要求1所述的生物合成原儿茶酸甲酯的菌株催化制备原儿茶酸甲酯的方 法， 其特征在于， 包括以下步骤： （1） 培养发酵： 将重组菌株sHG10接种到50~200mL LB液体培养基中， 在37℃、 220rpm下 进行培养发酵； （2） 诱导表达： 当发酵液中 的细胞OD600达到0.2~1.2， 加入 终浓度为0.2mM的异丙基 ‑β‑ D‑硫代半乳糖苷 （IPTG） ， 在3 0~40℃下诱 导培养2h； （3） 生物合成： 向诱导后的发酵液中加入对羟基苯甲酸甲酯， 震荡培养2~12 h， 获得含 有原儿茶酸甲酯的发酵液， 发酵液经离心过膜后， 采用高效液相色谱仪测定原儿茶酸甲酯 的产量； LB液体培 养基的配方： 每升 培养基， 胰蛋白胨10g， 酵母提取物5g， NaCl  10g， 其余纯水。 9.根据权利要求8所述的生物合成原儿茶酸甲酯的菌株催化制备原儿茶酸甲酯的方 法， 其特征在于， 所述重组菌株sHG10的接种量 为1%。 10.根据权利要求8所述的生物合成原儿茶酸甲酯的菌株催化制备原儿茶酸甲酯 的方 法， 发酵液中的对羟基苯甲酸甲酯的初始浓度为1g/L。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114606174 A 3