(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210444378.5 (22)申请日 2022.04.26 (71)申请人 广东海大 畜牧兽医研究院有限公司 地址 511400 广东省广州市番禺区沙 头街 小平工业区福平路 八街5号 (72)发明人 伍建敏　罗梦萍　李中圣　罗律　 (74)专利代理 机构 广州嘉权专利商标事务所有 限公司 4 4205 专利代理师 林德强 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/46(2006.01) (54)发明名称 一种罗非鱼链球菌病双重荧光PCR检测引物 探针组及冻干型 试剂盒 (57)摘要 本发明属于生物检测技术领域， 公开了一种 罗非鱼链球菌病双重荧光PCR检测引物探针组及 冻干型试剂盒， 具体公开了一种试剂， 包括引物 组和/或探针组。 本发明提供的试剂可用于同时 检测无乳链球菌和海豚链球菌， 实现在一管反应 中只进行1次PCR扩增即可对罗非鱼链球菌病的 两种病原进行检测。 权利要求书2页 说明书14页 序列表3页 附图6页 CN 114686612 A 2022.07.01 CN 114686612 A 1.一种试剂， 其特征在于， 所述试剂包括引物 组和/或探针组， 所述引物 组包括引物1和 引物2， 所述探针组包括探针1和探针2； 其中， 所述引物1的序列为： Saga‑rtF： 5’ ‑AACGGTTAATGAGGCTATTACTAG‑3’， 或为该序列的互补序列； Saga‑rtR： 5’ ‑AGGCTTCTACACGACTAC C‑3’， 或为该序列的互补序列； 所述引物 2的序列为： Sini‑rtF： 5’ ‑GGAAGTACGTTTGGAAGTCTTA‑3’， 或为该序列的互补序列； Sini‑rtR： 5’ ‑CGAACTAAAATCTTAGTGAAAATGA‑3’， 或为该序列的互补序列； 所述探针1的序列为： Saga‑rtProbe： 5 ’ ‑AGACTTCATTGCGTGCCAACCCTGAGA‑3’， 或为该序列的互补序列； 所述探针2的序列为： Sini‑rtProbe： 5 ’ ‑TAGGAAAGAGACGCAGTGTCA AAAGAC‑3’， 或为该序列的互补序列。 2.根据权利要求1所述的试剂， 其特征在于， 所述试剂还包括冻干保护剂； 优选地， 所述 试剂还包括PCR反应液。 3.根据权利要求2所述的试剂， 其特征在于， 所述冻干保护剂为海藻糖、 蜜三糖、 甘露 醇、 甘氨酸、 PEG中的一种或多种。 4.根据权利要求1～3中任一项所述的试剂， 其特征在于， 所述探针序列两端均分别标 记有荧光基团和淬灭基团， 各探针序列之间标记的荧 光基团不同。 5.权利要求2～4中任一项所述的试剂的制备方法， 包括以下步骤： 将引物和/或探针 组、 冻干保护剂和PCR反应液混合， 冻干， 即得到试剂。 6.根据权利要求5所述的制备方法， 其特征在于， 所述冻干的程序为 ‑50～‑35℃预冻2 ～4h，‑30～‑40℃升华1 1～12h， 20～3 0℃升华4～6h。 7.一种试剂盒， 其特征在于， 所述试剂 盒包括权利要求1～4中任一项所述的试剂； 优选 地， 所述试剂盒还 包括阴性对照品和阳性对照品。 8.权利要求1～4中任一项所述的试剂或权利要求7所述的试剂盒在(1)～(6)中任一项 的应用； (1)鉴别无乳链球菌和/或海豚链球菌； (2)制备鉴别无乳链球菌和/或海豚链球菌的产品； (3)检测待测样品是否为无乳链球菌或海豚链球菌； (4)制备检测待测样品是否为无乳链球菌和/或海豚链球菌的产品； (5)检测待测样品是否感染无乳链球菌和/或海豚链球菌； (6)制备检测待测样品是否感染无乳链球菌和/或海豚链球菌的产品； 上述应用 用于非疾病的诊断。 9.一种同时检测无乳链球菌和/或海豚链球菌的双重荧光PCR检测方法， 采用权利要求 1～4中任一项所述的试剂或权利要求7 所述的试剂盒进行。 10.根据权利要求9所述的检测方法， 其特 征在于， 所述检测方法具体包括以下步骤： (1)从待测样品中提取核酸； (2)以步骤(1)的核酸为模板， 用所述试剂或所述试剂盒进行双重荧光PCR扩增反应， 收 集荧光信号；权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114686612 A 2(3)根据荧 光信号判定待测样品中是否含有无乳链球菌和/或海豚链球菌； 上述方法为非疾病诊断方法。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114686612 A 3