(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210437573.5 (22)申请日 2022.04.25 (71)申请人 安徽中医药大学第一附属医院 （安 徽省中医院） 地址 230031 安徽省合肥市梅 山路117号 (72)发明人 杨文明　姜辉　郝文杰　周红　 谢文婷　韩燕全　陈娜　 (74)专利代理 机构 合肥辉达知识产权代理事务 所(普通合伙) 3416 5 专利代理师 汪守勇 (51)Int.Cl. C12Q 1/6883(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 LncRNA ENST00000415520.5的应用及检测 方法 (57)摘要 LncRNA ENST00000415520.5的应用及检测 方法， 属于阿尔茨海默病(AD)分子生物学技术领 域。 本发明根据提取患者外周血的总RNA序列， 设 计并合成特异性PCR引物， 即核苷酸序列如SEQ   ID NO.1和SEQ  ID NO.2所示的引物对， 并利用 RT‑qPCR技术， 发现该LncRNA在阿尔茨海默病 (AD)患者外周血PBMC中的表 达显著上升， 并且与 阿尔茨海默病的MoCA、 MMSE等指标呈明显负相 关。 因此， 检测LncRNA  ENST00000415520.5的表 达量可应用于阿尔茨海默病(AD)的辅助诊断、 治 疗、 预后评估等制剂的制备。 权利要求书1页 说明书4页 序列表8页 附图1页 CN 115478104 A 2022.12.16 CN 115478104 A 1.一种检测LncRNA  ENST00000415520.5表达量 的制剂在制备阿尔茨海默病检测制剂 中的应用， 其特征在于， 所述检测LncRNA  ENST00000415520.5表达量的制 剂包括： 2 ×SYBR  Green mixture 5uL、 浓度为50ng/μL 的cDNA 1uL、 浓度均为10umol/L 的核苷酸序列如SEQ   ID NO.1和SEQ  ID NO.2所示的引物对各1 μl、 RNase  Free water 2uL。 2.一种检测L ncRNA ENST00000415520.5表达量的方法， 其特 征在于， 步骤如下： ①、 阿尔茨海默病患者PBM Cs提取 室温条件下， 在50mL离心管中加入6mL  Ficoll‑Paque PLUS； 10mL离心管中加入4mL新 鲜的抗凝血和等量的PBS， 混匀， 将稀释过的血液样本小心铺到Ficoll ‑Paque分离液上面， 然后将离心管置于水平式离心机内， 19℃400g离心35min； 离心后分4层， 从上往下依次为： 血浆层、 单核细胞层、 Ficoll ‑Paque PLUS、 红细胞层， 吸掉血浆层， 将单核细胞层转移到另 一离心管中， 加入至少3倍体积的PBS， 混匀， 19℃400g离心15min， 弃上清； 加入6mL  PBS重悬 细胞， 19℃100g离心10min， 弃上清； 再加入1mL  PBS重悬细胞， 然后转移 到1.5mL EP管中， 19 ℃100g离心10mi n， 弃上清， 置‑80℃冰箱保存； ②、 RNA提取 收集好的细 胞沉淀在室温条件下加入1ml  TRIzol裂解至液体澄清且无细胞团状态； 加 入0.2mL氯仿， 剧烈振荡15秒， 室温放置5分钟； 4℃12000rpm离心10分钟， 取上清加入到另一 EP管中； 加入0.5mL预冷的异丙醇， 温和混匀， 冰上孵育30分钟； 4℃12000rpm离心15分钟， 弃 去上清； 加入1mL预冷的75 ℅乙醇， 4℃12000rpm离心5分钟， 弃上清； 反复洗涤2次； 室温干燥 RNA沉淀， 加入20 ‑50 μL DEPC水，‑80℃保存备用； ③、 RNA浓度和纯度测定 用移液器取RNA样品1μL至缓冲液中， 测定其在260nm和280nm处吸光值； 根据OD260/ OD280比值， 估测RNA质量； OD260/OD280比值在1.8 ‑2.0之间， 可以满足实验要求； 当OD260/ OD280<1.8时， 溶 液中蛋白的污染比较明显； 当 OD260/OD280>2.2时， 说明RNA已经降解； ④、 RT反应 反转录制剂盒PrimeScriptRT  reagent Kit； 分为两步： 第一步去除基因 组DNA； 反应体系： 加入总RNA(质量为1 μg)、 5 ×gDNA Eraser Buffer 2.0 μL， gD NA Eraser 1.0 μL， DEPC水补足至10 μL， 然后PCR仪上42℃2mi n； 第二步反转录； 反应体系： 第一步反应液10μL、 PrimeScript  RT Enzyme Mix I 1.0μL、 RT  Primer  Mix1.0 μL、 RNase  Free dH2O 4.0 μL、 Pr imerScript Buffer 24.0 μL， 37℃， 15 min； 85℃， 5s， 取出上述反应液， 即为cDNA， ‑80℃保存备用； ⑤、 荧光定量PCR反应 取出cDNA作为荧光定量的模板， 反应体系： 2 ×SYBR Green mixture 5uL、 正反向引物 (10uM)各1uL、 模板cDNA  1uL、 RNase  Free water 2uL， 在荧光定量PCR仪上进行PCR扩增反 应， 反应条件为95℃1min， 随后95℃20s、 60℃1min进行40个循环， 得到每个样品的CT值， 以 β‑actin作为内参 参照基因， 实验结果采用2‑△ △CT的方法进行分析。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115478104 A 2LncRNA ENST00000415520.5的应用及检测方 法 技术领域 [0001]本发明属于阿尔茨海默病分子生物学技术领域， 具体涉及一种LncRNA   ENST00000415520.5的应用及检测方法。 背景技术 [0002]阿尔茨海默病(AD)是一种起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性疾病。 临床上 以记忆障碍、 失语、 失用、 失认、 视空间能力损害、 执行功能障碍以及人格和行为改变等全面 性痴呆表现为特征， 病因迄今未明。 65岁以前发病者称早老性痴呆， 65岁以后发病者称老年 性痴呆。 目前为止， 阿尔茨海默病(AD)还 是不能被治愈的， 可能与其 发病机制尚不完全清楚 有关。 因此， 寻找阿尔茨海默病(AD)早期诊断的生物标记物， 对其治疗及预后具有积极的意 义。 [0003]近年来， 由于高通量测序技术的快速发展， 越来越多的非编码RNA(non ‑coding  RNA)， 如环状RNA、 长链非编码RNA(LncRNA)、 微小RNA等在疾病的诊断及检测中发挥着重要 的作用。 本发明正是基于一种LncRNA——ENST00000415520.5(其成熟剪切序列、 全序列分 别如SEQ ID NO.3和SEQ  ID NO.4所示)， 进行阿尔茨海默病(AD)的诊断及检测。 目前， 该 LncRNA在阿尔茨海默病(AD)检测、 诊断及治疗中的应用尚未 见报道。 发明内容 [0004]针对现有阿尔茨海默病(AD)检测、 诊 断及治疗方面存在的技术缺陷， 本发明提出 了一种LncRNA  ENST00000415520.5的应用及检测方法， 能够实现阿尔茨海默病(AD)的诊断 及检测。 [0005]本发明的所采用的技术方案为： 一种检测LncRNA  ENST000004 15520.5表达量的制 剂在制备阿尔茨海默病检测制剂中的应用， 所述检测LncRNA  ENST00000415520.5表达量的 制剂包括： 2×SYBR Green mixture 5uL、 浓度为50ng/ μL的cDNA  1uL、 浓度均为10umol/L的 核苷酸序列如SEQ  ID NO.1和SEQ  ID NO.2所示的引物对各1 μl、 RNase  Free water 2uL。 [0006]一种检测L ncRNA ENST00000415520.5表达量的方法， 步骤如下： [0007]①、 阿尔茨海默病(AD)患者PBM Cs提取 [0008]室温条件下， 在50mL离心管中加入6mL  Ficoll‑Paque PLUS； 10mL离心管中加入 4mL新鲜的抗凝血和等量的PBS， 混匀， 将稀释过的血液样本小心铺到Ficoll ‑Paque分离液 上面， 然后将离心管置于水平式离心机内， 19℃400g离心35min； 离心后分4层， 从上往下依 次为： 血浆层、 单核细胞层、 Ficoll ‑Paque PLUS、 红细胞层， 吸掉血浆层， 将单核细胞层转移 到另一离心管中， 加入至少3倍体积的PBS， 混匀， 19℃400g离心15min， 弃上清； 加入6mL  PBS 重悬细胞， 19℃100g离心10min， 弃上清； 再加入1mL  PBS重悬细胞， 然后 转移到1.5mL  EP管 中， 19℃10 0g离心10mi n， 弃上清， 置‑80℃冰箱保存； [0009]②、 RNA提取 [0010]收集好的细胞沉淀在室温条件下加入1ml  TRIzol裂解至液体澄清且无细胞团状说　明　书 1/4 页 3 CN 115478104 A 3