(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210438502.7 (22)申请日 2022.04.25 (71)申请人 华南农业大 学 地址 510000 广东省广州市天河区五山路 483号 (72)发明人 赵力超　林丽　谭有将　梁德智　 文媛怡　 (74)专利代理 机构 广州正明知识产权代理事务 所(普通合伙) 44572 专利代理师 成姗 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/42(2006.01) (54)发明名称 一种基于PMAxx-LAMP-NALFA快速检测沙门 氏菌活菌试剂盒及检测方法 (57)摘要 本发明涉及微生物检测技术领域， 特别是涉 及一种基于PMAxx ‑LAMP‑NALFA快速检测沙门氏 菌活菌试剂盒及检测方法。 所述试剂盒包含 PMAxx、 LA MP扩增反应 液和核酸检测试纸条。 本发 明采用的PMAxx染料处理细菌后进行LAMP扩增， 能有效区分细菌的死活性， 能消除死菌对检测结 果带来的假阳性干扰， 能有效缩短检测时间， 降 低成本， 提高检测精度， 实现 现场快速 检测。 权利要求书2页 说明书5页 序列表2页 附图1页 CN 114891903 A 2022.08.12 CN 114891903 A 1.一种基于PMAxx ‑LAMP‑NALFA快速检测沙门氏菌活菌检测试剂盒， 其特征在于， 包含 PMAxx、 LAMP扩增反应液和核酸检测试纸条。 2.根据权利要求1所述的基于PMAxx ‑LAMP‑NALFA快速检测沙门氏菌活菌检测试剂盒， 其特征在于， 所述LAMP扩增反应液为23μL， 包括： 0.2μM引物F3、 0.2μM引物B3， 1.6μM引物 FIP、 1.6 μM引物BIP、 0.8 μM引物LF、 0.8 μM引物LB， 2.5 μL缓冲液， 6mM  Mg2+， 0.6M甜菜碱， 6U的 Bst DNA聚合酶， 1.4mM  dNTP， 此外还有20 μL石蜡油液封； 所述引物 FIP、 BIP、 F3、 B 3、 LF、 LB序列分别如SEQ  ID No.1、 SEQ  ID No.2、 SEQ  ID No.3、 SEQ ID No.4、 SEQ ID No.5、 SEQ ID No.6所示。 3.根据权利要求2所述的基于PMAxx ‑LAMP‑NALFA快速检测沙门氏菌活菌检测试剂盒， 其特征在于， 所述引物FIP的5 ’端标记FITC， LF的5 ’端标记生物素。 4.根据权利要求1所述的基于PMAxx ‑LAMP‑NALFA快速检测沙门氏菌活菌检测试剂盒， 其特征在于， 所述PMAx x浓度为2mM 。 5.根据权利要求1所述的基于PMAxx ‑LAMP‑NALFA快速检测沙门氏菌活菌检测试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒还包括核酸检测试纸条运行缓冲液和阴性对照样品， 运行缓冲液 为含有2％S9的磷酸盐缓冲溶 液， 阴性对照样品为无核酸的DEPC水。 6.根据权利要求1所述的基于PMAxx ‑LAMP‑NALFA快速检测沙门氏菌活菌检测试剂盒， 其特征在于， 所述核酸检测试纸条包括样品垫、 结合垫、 NC膜、 吸水垫及底板， 所述NC膜上分 别设有包被链霉亲和素的检测线T线以及 包被有羊抗鼠IgG抗体或兔抗鼠IgG抗体的质控线 C线， 所述NC膜设置在所述底板上， 所述样 品垫、 结合垫与所述NC膜靠近所述检测线一端依 次连接， 所述吸水垫与所述 NC膜靠近所述质控线一端连接 。 7.根据权利要求6所述的基于PMAxx ‑LAMP‑NALFA快速检测沙门氏菌活菌检测试剂盒， 其特征在于， 所述核酸检测试纸条的结合垫的制备步骤如下： 制备彩色微球标记FITC抗体， 将彩色微球标记FITC抗体稀释于结合垫处理液， 将所述溶液滴加 至所述结合垫上， 45℃烘 干3～4小时。 8.根据权利要求6所述的基于PMAxx ‑LAMP‑NALFA快速检测沙门氏菌活菌检测试剂盒， 其特征在于， 所述核酸检测试纸条 的检测线和质控线的制备步骤如下： 将磷酸盐缓冲溶液 稀释后的链霉亲和素和羊抗鼠IgG抗体， 分别划线于所述NC膜上， 包被浓度为0.5～1.5mg/ mL， 置于37℃烘箱过夜。 9.根据权利要求1所述的基于PMAxx ‑LAMP‑NALFA快速检测沙门氏菌活菌检测试剂盒， 其特征在于， 所述核酸检测试纸条具有检测腔， 并设有与所述检测腔连通的加样槽和观察 窗， 所述核酸检测试纸条安装在所述检测腔内。 10.权利要求1所述的基于PMAxx ‑LAMP‑NALFA快速检测沙门氏菌活菌检测试剂盒的检 测方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： S1将待测样品与所述的PMAxx混匀， 使体系中PMAxx终浓度为2～20μM， 避光染色5～ 20min， 在核酸标记仪进行5～15min的光活化处理， 10000rpm离心2min后， 用磷酸盐缓冲溶 液重悬， 再进行离心， 用TE水重悬， 10 0℃加热10mi n， 冰浴5mi n， 12000rpm离心 2min； S2用移液枪吸取2μL步骤S1离心后的上清液加入到所述的LAMP扩增反应液中， 60～65 ℃扩增30～60min后85℃加热5mi n； S3向所述的核酸检测试纸条加入2～ 10 μL扩增样品， 再加入70～98 μL运行缓冲液， 反应权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114891903 A 25～15min， 根据核酸检测试纸条的显色带判断检测结果。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114891903 A 3