(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210436646.9 (22)申请日 2022.04.25 (71)申请人 成都百思赛弗生物科技有限公司 地址 610200 四川省成 都市双流区天府国 际生物城(凤 凰路618号) (72)发明人 李望丰　唐云轩　黄盈　张栋梁　 郎小亮　李珊　 (74)专利代理 机构 北京超凡宏宇专利代理事务 所(特殊普通 合伙) 11463 专利代理师 任燕妮 (51)Int.Cl. C12Q 1/6806(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/6883(2018.01) (54)发明名称 一种等温扩增靶 核酸序列的方法 (57)摘要 本发明公开了一种等温扩增靶核酸序列的 方法， 涉及核 酸扩增技术领域。 其包括： 分别设计 正向扩增引物F1和F2； 阻滞引物B1和B2； 正向扩 增引物的剥离引物D1和D2； 反向扩增引物R1和 R2； 反向扩增产物的剥离引物RS1和RS2。 通过利 用两个靶基因互作识别， 完成两个靶基因的等温 同步扩增。 本发明引物设计简单可靠， 灵敏度高， 特异性高。 本发明的等温扩增技术， 在医学检测、 生物科研、 农业科研、 防控防疫、 生物安全等领 域， 提供了一种新的解决方案 。 权利要求书2页 说明书9页 附图4页 CN 114592037 A 2022.06.07 CN 114592037 A 1.一种等温扩增靶核酸序列的方法， 其特征在于， 所述方法以非疾病的诊断为目的， 其 包括： a、 设计正向扩增引物F1和F2； 其包括： 正向扩增引物F1和F2分别与靶序列T1和靶序列T2配对以延伸扩增， 在正向扩增引物F1 和F2的5’端分别设计有反向序列RS2和RS1， 且所述RS2与所述靶序列T2的SD2序列互补； 所 述RS1与所述靶序列T1的SD1序列互补； 所述SD2和SD1分别位于所述靶序列T2和所述靶序列 T1的上游； b、 设计阻滞引物B1和B2； 其包括： 在所述SD2和SD1的上游分别设计阻滞引物B2和B1， 通过正向扩增引物F1和F2、 阻滞引 物B1和B2以使得核酸扩增延伸分别在SD1和SD2的下游位置时， 延伸结束， 完成首轮复制扩 增； c、 设计正向扩增引物的剥离引物D1和D2； 其包括： 在所述正向扩增引物F1和F2的上游分别设计正向扩增引物的剥离引物D1和 D2， 用于首 轮扩增产物的置换获得 首轮扩增产物的单链； 使首轮扩增产物头尾互补杂交后， 形成L oop结构， 为后续扩增准备模板； d、 根据所述靶序列T1和靶序列T2设计反向扩增引物R1和R2， 以所述首轮扩增形成的 Loop结构为模板进行扩增； e、 设计反向扩增产物的剥离引物RS1和RS2， 将所述步骤d的扩增产物进行置换获得新 的单链； 使得新的扩增产物头尾互补杂交后， 再次形成L oop结构； f、 将所述靶序列T1和靶序列T2以线性的方式或高级结构的方式进行扩增， 通过扩增延 伸—链置换—Loop形成—扩增延伸的模式， 循环往复， 使得两个扩增靶序列同步进行核酸 扩增。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述方法中用于扩增所采用的酶选自DNA 聚合酶和/或逆转录酶。 3.根据权利要求2所述的方法， 其特征在于， 所述方法中用于扩增所采用的DNA聚合酶 选自如下酶中的至少一种： Bst  DNA聚合酶， Klenow  DNA聚合酶， T4DNA聚合酶， Taq  DNA聚合 酶， DNA聚合酶I， Vent  DNA聚合酶， Phi29  DNA聚合酶， TneDNA聚合酶， Tma  DNA聚合酶， P fu  DNA聚合酶， KOD  DNA聚合酶， Tfl  DNA聚合酶， Tth  DNA聚合酶， Stoffel片段DNA聚合酶和 DEEPVENT DNA聚合酶。 4.根据权利要求2所述的方法， 其特征在于， 所述方法中用于扩增所采用的逆转录酶选 自如下酶中的至少一种： M‑MLV逆转录酶， AMV逆转录酶， RSV逆转录酶， RAV逆转录酶， MAV逆转录酶和HIV逆转录 酶。 5.根据权利要求2所述的方法， 其特 征在于， 所述方法中用于扩增所采用的酶选自： Bst DNA聚合酶和M ‑MLV逆转录酶。 6.根据权利要求1 ‑5任一项所述的方法， 其特征在于， 所述方法中的扩增反应为恒温扩 增； 优选地， 在5 5‑72℃下扩增； 优选地， 扩增时间为15 ‑90min。 7.根据权利 要求1‑5任一项所述的方法， 其特征在于， 所述方法中阻滞引物B1和B2的3 ’权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114592037 A 2端还设置有封闭基团； 优选地， 所述封闭基团选自C3  Spacer， C6  Spacer， C12  Spacer， Spacer18、 氨基、 双脱 氧、 碱基倒置、 BHQ1、 BHQ2和MGB中的任意 一种。 8.根据权利要求1 ‑5任一项所述的方法， 其特 征在于， 所述靶基因的数目为2的倍数； 优选地， 所述靶基因的数目为2、 4或6 。 9.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述高级结构是指： 扩增以二级结构、 或以 线性结构和二级结构混合的方式进行。 10.根据权利要求1 ‑5任一项所述的方法， 其特 征在于， 所述靶基因的核酸 为DNA或RNA。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114592037 A 3