(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210438091.1 (22)申请日 2022.04.25 (71)申请人 安徽医科 大学第一附属医院 地址 230000 安徽省合肥市绩溪路218号 (72)发明人 邹薇薇　纪冬梅　宗凯　曹云霞　 刘雅静　章志国　梁春梅　梁丹　 魏兆莲　周平　 (74)专利代理 机构 北京东方盛凡知识产权代理 事务所(普通 合伙) 11562 专利代理师 李瑞雨 (51)Int.Cl. C12Q 1/6883(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种定量检测MT-ATP6 m.9185位点异质性 的引物组、 探 针和试剂盒 (57)摘要 本发明公开了一种定量检测MT ‑ATP6m.9185 位点异质性的引物组、 探针和试剂盒， 涉及生物 技术领域。 所述引物组包括如SEQ  ID NO:1所示 的上游引 物和如SEQ  ID NO:2所示的下游引 物； 所述探针包括如SEQ  ID NO:3所示的野 生型探针 和如SEQ ID NO:4所示的突变型探针。 所述试剂 盒包括上述的引物组和探针。 本发 明提供了一种 定量检测MT ‑ATP6m.9185位点异质性的引 物组、 探针和试剂盒， 可以实现对人单细胞样本MT ‑ ATP6m.9185位点异质性的高准确性、 高灵敏性和 高重复性检测。 权利要求书1页 说明书4页 序列表1页 附图4页 CN 114752667 A 2022.07.15 CN 114752667 A 1.一种定量检测人单细胞样本MT ‑ATP6m.9185位点异质性的引物组和探针， 其特征在 于， 所述引物组包括如SEQ  ID NO:1所示的上游引物和如SEQ  ID NO:2所示的下游引物； 所 述探针包括如SEQ  ID NO:3所示的野生型探针和如SEQ  ID NO:4所示的突变型探针。 2.一种定量检测人单细 胞样本MT ‑ATP6m.9185位点异质性的试剂盒， 其特征在于， 包含 权利要求1所述的引物组和探针。 3.根据权利要求2所述的试剂盒， 其特 征在于， 所述试剂盒还 包括Taq酶、 dNTPs和Mg2+。 4.如权利要求1所述的引物组和探针在制备定量检测人单细胞样本MT ‑ATP6m.9185位 点异质性的试剂或试剂盒中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114752667 A 2一种定量 检测MT‑ATP6 m.9185位点 异质性的引物组、 探针和 试剂盒 技术领域 [0001]本发明涉及生物技术领域， 特别是涉及一种定量检测MT ‑ATP6m.9185位点异质性 的引物组、 探针和试剂盒。 背景技术 [0002]线粒体DNA(mitochondr ial DNA， mtDNA)的MT ‑ATP6基因编码线 粒体能量代谢关键 酶F1F0ATP合酶复合体 的ATP6亚基。 MT ‑ATP6突变一直被认为是线粒体病的致病原因之一。 m.9185T>C突变首次在一名7岁患者中被发现， 该患者出现突发性上 睑下垂、 眼底麻痹和疲 劳。 尽管m.9185T>C在异质性为85％时， 出现的是孤立的轴突神经病， 但是更高的突变负荷 会导致更严重的神经表型， 包括神经源性肌无力、 共济失调、 色素性视网膜炎， 以及早发型 和晚发型Leigh综合征(Leigh  syndrome,LS)。 并且， m.9185T>C表现出惊人的疾病表型的组 织特异性。 LS是最常见的线 粒体病， 其临床表型包括伴有基底节区和/或脑干功能障碍的神 经系统症状。 LS通常出现在幼儿期， 患者表现为生长发育迟缓、 脑病、 肌张力障碍、 基底节区 和脑干的T2对称高信号。 此外， 还可出现中枢神经系统以外的全身性问题， 如肾衰竭、 心肌 病、 糖尿病等， 使LS成为 一种具有 多种临床特 征的疾病。 [0003]目前线粒体病没有特殊的治疗方法， 仅能对症治疗， 患者致死致残率高。 因此， 预 防线粒体病孩子的出生就成为阻断线粒体病传递的唯一方法。 然而， 相对于核基因组导致 的遗传病， 产前诊断(prenatal  diagnosis,PD)和胚胎置入前遗传学诊断(prei   mplantation  genetic diagnosis,PGD)在阻断mtDNA突变导致线粒体病的传递的临床应用 上面临挑战。 由于mtDNA遵循母系遗传， 后代中突变mtDNA的比例与母亲相关。 然而， 由于 mtDNA在卵母细胞发育过程中的遗传瓶颈效应， 导致卵母细胞中可能出现完全不同于母体 的异质性变化， 瓶颈效应会导致后代异质性具有一定的不可预测性。 并且， 由于 m.9185相关 突变的异质性程度与疾病严重程度明显相关， 因此在产前诊断和胚胎植入前遗传学过程 中， 对脐血、 羊水， 以及胚胎活检的单细胞样本的m.9185突变异质性的准确定量至关重要。 [0004]目前， 有多种方法可以检测mtDNA异质性， 包括二代测序法(Next ‑generation  se  quencing,NGS)、 Sanger测序法、 高效液相色谱法(high ‑performance  liquid chromat  ography,HPLC)、 SNaPshot、 焦磷酸测序、 荧光定量PCR法等。 HPLC虽然可以检测mtDNA突变位 点基因型， 但是无法定量突变负荷。 Sanger测序法和SNaPshot对异质性<5％的样本敏感性 低。 荧光定量PCR依赖于标准溶解曲线， 因而只能实现相对定量， 且PCR影响因素多， 易受样 本中各种金属离子等PCR抑制物的影响。 焦磷酸测序和NGS， 尤其是NGS， 被广泛应用于 mtDNA 异质性水平的定量， 特别是对异质性 非常低的样品， 结果准确、 灵敏， 但是二者成本过高， 难 以在大规模临床 样本中推广。 发明内容 [0005]本发明的目的是提供一种定量检测MT ‑ATP6m.9185位点异质性的引物组、 探针和说　明　书 1/4 页 3 CN 114752667 A 3