(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210441411.9 (22)申请日 2022.04.25 (71)申请人 武汉轻工大 学 地址 430023 湖北省武汉市东西湖区常青 花园学府南路68号 (72)发明人 李龙杰　吴钰周　邓玉凯　肖先金　 颜贝　曾永辉　 (74)专利代理 机构 北京金智普华知识产权代理 有限公司 1 1401 专利代理师 张晓博 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种荧光探针、 检测方法及应用 (57)摘要 本发明属于荧光探针检测技术领域， 公开了 一种荧光探针、 检测方法及应用， 构建调控DNA链 置换反应的新型元件DNA楔形元件； 基于楔形元 件的调控特性， 对基因突变检测方法进行改进， 设计一种“信号抑制型 ”的基因突变检测新方法； wtDNA触发的荧光信号被完全互补配对的楔形元 件猝灭， 而与楔形元件有一个碱基错配的mtDNA 所触发的荧光信号则不受影响。 本发明的 “信号 抑制型”探针从原理上对传统方法进行优化改 进， 使检测体系中荧光的产生对突变位点的位置 和类型无选择性， 因而可对未知突变进行检测， 且优化成本低， 实现较高通量的突变检测， 减轻 社会与患者的经济负担 。 权利要求书2页 说明书9页 序列表2页 附图4页 CN 114959027 A 2022.08.30 CN 114959027 A 1.一种荧光探针检测方法， 其特征在于， 所述荧光探针检测方法包括： 构建调控DNA链 置换反应的新型元件DNA楔形元件； 基于楔形元件的调控 特性， 对基因突变检测方法进 行改 进， 获取信号抑制型的基因， 用于突变检测； wtDNA触发的荧光信号被完全互补配对的楔形 元件猝灭， 与楔形 元件碱基错配的mtDNA 始终触发荧 光信号。 2.如权利要求1所述 荧光探针检测方法， 其特 征在于， 所述楔形 元件的构建方法包括： 采用包含辅助序列的链置换序列通用结构， 在链置换过程中添加一个新的独立调节元 件； 所述辅助序列用于为楔 形元件提供 空间平台； 所述楔形元件由结构域I和结构域T组成， 所述结构域I被设计成与入侵链的辅助序列结构域或辅助域互补， 所述结构域T被 设计成与 模板链的辅助域互补； 楔形 元件与入侵链和模板链杂交后， 形成楔形三联体。 3.如权利要求1所述型荧光探针检测方法， 其特征在于， 所述型荧光探针检测方法还包 括： 通过改变I ‑T和T‑I之间两个结构域的位置连接顺序实现双向调节； 当结构域 I和结构域T分别与入侵链和底 物链结合后， 形成楔形的夹角。 4.如权利要求1所述荧光探针检测方法， 其特征在于， 所述型荧光探针检测方法包括以 下步骤： 步骤一， 序列设计： 设计并合成野生型PTEN基因wtDNA、 突变型PTEN基因mtDNA、 模板链、 目标链以及N W； 步骤二， 向EP管中加入10 ×ThermoPol缓冲液， 再加入目标链、 模板链和去离子水， 在 金 属浴中按照已设定的程序加热和退火混合物； 步骤三， 将退火后的混合物加入酶标条中， 加入NW、 入侵链和去离子水， 用离心机将溶 液全部离心到底部， 置 于酶标仪中检测荧 光强度。 5.如权利要求4所述荧光探针检测方法， 其特征在于， 所述步骤一中的wtDNA的核苷酸 序列为SEQ  ID NO： 1， 所述mtDNA的核苷酸序列为SEQ  ID NO： 2， 所述模板链的核苷酸序列为 SEQ ID NO： 3， 所述目标链的核苷酸序列为SEQ  ID NO： 4， 所述NW的核苷酸序列为SEQ  ID  NO： 5。 6.如权利要求4所述型荧光探针检测方法， 其特征在于， 所述步骤二中的10 × ThermoPol 缓冲液的加入量为4.8 μL， 所述目标链的终浓度为250nM， 所述模板链的终浓度为 250nM， 用去离子水使总体积达到46μL； 所述已设定的程序为： 85℃1min， 55℃1min， 37℃ 5min。 7.如权利要求4所述 “turn‑on”型荧光探针检测方法， 其特征在于， 所述步骤三中的退 火后的混合物为46 μL， 所述NW的终浓度为500nM， 所述入侵链的终浓度为250nM， 用去离子水 将总体积补足到 50 μL， 最终的摩尔比为： 模板链： 入侵链： 目标链： 楔形 元件＝1.0 5： 1： 1： 1； 所述离心条件为： 3500rpm， 室温， 1.5min， 置于酶标仪中检测37℃温度下的荧光强度； 所述荧光记录的激发/发射波长为485nm/525nm， 荧光强度每45s测量一次， 总检测时间为 3600s或5400s。 8.一种应用如权利要求1～7任意 一项所述的荧 光探针检测方法的荧 光探针。 9.一种荧光探针检测试剂盒， 其特征在于， 所述荧光探针检测试剂盒包括应用 如权利 要求1～7任意一项所述的荧光探针检测方法中核苷酸序列为SEQ  ID NO： 1～核苷酸序列 SEQ ID NO： 5。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114959027 A 210.一种如权利要求1～7任意一项所述的荧光探针检测方法在未知基因突变检测中的 应用。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114959027 A 3