(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210448441.2 (22)申请日 2022.04.24 (71)申请人 河南科技大 学 地址 471000 河南省洛阳市洛龙区开元 大 道263号 申请人 洛阳薯乡薯业科创园有限公司 (72)发明人 张小梅　李广录　侯文邦　 (74)专利代理 机构 郑州中科鼎佳专利代理事务 所(特殊普通 合伙) 41151 专利代理师 李路平 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/94(2006.01) (54)发明名称 一种同时检测3种甘薯病毒的多重检测方法 及试剂盒 (57)摘要 一种涉及甘薯病毒检测技术领域的同时检 测3种甘薯病毒的多重检测方法及试剂盒， 所述 试剂盒包含10 ×反应缓冲液、 Taq酶、 3种甘薯病 毒的上游引物、 3种甘薯病毒的下游引物、 阳性标 准品； 所述3种甘薯病毒分别为甘薯褪绿矮化病 毒、 甘薯羽状斑驳病毒和甘薯潜隐病毒； 检测方 法包含以下步骤： ①提取待测样本总RNA， 并进行 反转录得cDNA； ②PCR扩增； ③取5μL步骤 ②的 PCR扩增产物在含5μg/ml嗅化乙啶(EB)的2%琼 脂糖凝胶上电泳； ④结果判定， PCR目的扩增片段 分别为150bp、 280bp、 480bp； 本发明可实现一次 PCR反应同时检测3种甘薯病毒， 减少操作次数， 避免交叉污染， 同时还减少试剂、 引物、 模板及耗 材等的使用量， 省时、 省力、 省成本 。 权利要求书1页 说明书4页 附图4页 CN 114807442 A 2022.07.29 CN 114807442 A 1.一种同时检测3种甘薯病毒的多重RT ‑PCR检测试剂盒， 其特征在于： 包括分别盛装有 10×反应缓冲 液1.5mL、 Taq酶 （1U/ μL） 1.5mL、 3种甘薯病 毒的上游引物混合物SP ‑F(10 μΜ)   0.5 mL、 3种甘薯病 毒的下游引物混合物SP ‑R(10 μΜ)  0.5 mL和阳性标准品(15 μg/mL)0.5   mL的离心管； 3种甘 薯病毒分别为甘 薯褪绿矮化病毒、 甘 薯羽状斑驳病毒和甘 薯潜隐病毒； 3种甘薯病毒的上游引物和下游引物分别为： ①甘薯褪绿矮化病毒  SPCSV‑F/R， 上游引物S PCSV‑F为5'‑CTTACCTCAGACCAGTTAGC‑3'， 下游引物S PCSV‑R为5'‑CGTTATTGTAGCCTCACCAG‑3'； ②甘薯羽状斑驳病毒 SPFMV F/R， 上游引物S PFMV‑F为5'‑GGCAGATTATGACGCACT TC‑3'， 下游引物S PFMV‑R为5'‑GTGTGCCTCTCCGTATCTTC‑3'； ③甘薯潜隐病毒  SPLV F/R， 上游引物S PLV‑F为5'‑CCAAGGCTACAAGGAGTCAG‑3'， 下游引物S PLV‑R为5'‑ACATTTCCATCCAAACCCGA‑3'； 所述阳性标准品为提取感染的甘薯病株RNA， 并分别进行反转录得cDNA， 利用3种甘薯 病毒的CP基因全长引物分别进 行PCR扩增， 将扩增产物进 行测序， 得到的阳性样品的CP基因 进行克隆载体的构建， 并将所 得3个重组载体质粒按1︰ 1︰ 1进行混合作为阳性标准品液。 2.如权利要求1所述的同时检测3种甘薯病毒 的多重RT ‑PCR检测试剂盒， 其特征是： 所 述10×反应缓冲液为Tris ‑HCl 100mM、 KCl 500mM和dNTPs  2.5mM。 3.如权利要求1所述的同时检测3种甘薯病毒 的多重RT ‑PCR检测试剂盒， 其特征是： 还 包括阴性对照， 该 阴性对照为纯 水或无病毒甘 薯总RNA。 4.一种同时检测3种甘 薯病毒的多重检测方法， 其特 征是： 包括以下步骤： ①用RNA提取 试剂盒(Takara)提取待测样本总RNA， 并进行反转录得cDNA； ②PCR扩增； 利用3种甘薯病毒的上游引物混合物SP ‑F和3种甘薯病毒的下游引物混合 物SP‑R对待测样品cDNA进行PCR扩增， 其反应条件为94℃预变性2min， 94℃变性30s， 60℃复 性30s， 72℃延伸3 0s， 循环32次， 最后72℃延伸5mi n； ③取5μL步骤 ②的 PCR扩增产物在含5μg/ml嗅化乙啶(EB)的2%琼脂糖凝胶上电泳， 恒 压100V， 20min后紫外透射反射仪上观察结果； ④结果判定； 当150bp处出现一条特异性核酸带， 而阴性对照没有目的条带， 说明样品中有甘薯褪绿 矮化病毒 （SPCSV） 侵染； 当28 0bp处出现一条特异性核酸带， 而阴性对照没有目的条带， 说明 样品中有甘薯羽状斑驳病毒 （SPFMV） 侵染； 当480bp处出现一条特异性核酸带， 而阴性对照 没有目的条 带， 说明样品中有甘 薯潜隐病毒 （S PLV） 侵染。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114807442 A 2一种同时检测3种甘薯病毒 的多重检测方 法及试剂盒 技术领域 [0001]本发明涉及甘薯病毒检测技术领域， 尤其是涉及一种同时检测3种甘薯病毒的多 重检测方法及试剂盒。 背景技术 [0002]公知的， 甘薯是利用块根进行无性繁殖的植物， 在栽培过程中极易受病毒的侵染， 病毒侵染后对甘薯的产量和品质有很大影响； 近年 我国甘薯病毒发生率呈上升趋势， 目前 在广东、 福建、 江苏、 四川、 北京、 山东等地均检测 到有多种病毒的混合侵染现象， 据报道中 国每年因甘薯病毒造成的损失 高达40亿 元， 甘薯病毒已经成为影响甘薯生产的重要限制因 素之一； 目前已经鉴定的甘薯病毒有甘薯羽状斑驳病毒 （Sweet  potato feathery  mottle  virus， SPFMV） 、 甘薯褪绿矮化病毒 （Sweet  potato chlorotic  stunt virus， SPCSV） 、 甘薯 潜隐病毒 （Sweet  potato latent virus， SPLV） 等； 而经常出现的情况就是多种甘薯病毒的 复合侵染， 极大的影响了甘薯产量的提高， 也直接制约了整个甘薯产业的整体发展； 使用茎 尖脱毒快繁法繁育甘薯试管苗， 能最大程度减少初期甘薯病毒病的发生， 诱导再生的 “脱毒 苗”需要经过严格的病毒检测， 确认不带病毒后， 才能后续供应给薯农种植， 但脱毒的试管 苗可能在田间种植阶段再次染上病毒病， 检测甘薯病毒病的方法就显得尤为重要； 但是目 前进行病毒检测 一个反应只能检测 一种病毒， 如果反应模板中含有两个以上 的甘薯病毒， 则需进行多次PCR， 成本高且费时费力。 发明内容 [0003]为了克服背景技术中不能 同时检测两个以上的甘薯病毒的问题， 本发明公开了一 种同时检测3种甘 薯病毒的多重检测方法及试剂盒。 [0004]为实现上述发明目的， 本发明采用如下技 术方案： 一种同时检测3种甘薯病毒的多重RT ‑PCR检测试剂盒， 包括分别盛装有10 ×反应 缓冲液1.5mL、 Taq酶 （1U/ μL） 1.5mL、 3种甘薯病毒的上游引物混合物SP ‑F(10 μΜ)  0.5 mL、 3 种甘薯病毒的下游引物混合物SP ‑R(10 μΜ)  0.5 mL和阳性标准品(15 μg/mL)0.5  mL的离心 管； 3种甘 薯病毒分别为甘 薯褪绿矮化病毒、 甘 薯羽状斑驳病毒和甘 薯潜隐病毒； 3种甘薯病毒的上游引物和下游引物分别为： ①甘薯褪绿矮化病毒  SPCSV‑F/R， 上游引物S PCSV‑F为5'‑CTTACCTCAGACCAGTTAGC‑3'， 下游引物S PCSV‑R为5'‑CGTTATTGTAGCCTCACCAG‑3'； ②甘薯羽状斑驳病毒 SPFMV F/R， 上游引物S PFMV‑F为5'‑GGCAGATTATGACGCACT TC‑3'， 下游引物S PFMV‑R为5'‑GTGTGCCTCTCCGTATCTTC‑3'； ③甘薯潜隐病毒  SPLV F/R， 上游引物S PLV‑F为5'‑CCAAGGCTACAAGGAGTCAG‑3'，说　明　书 1/4 页 3 CN 114807442 A 3