(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210435996.3 (22)申请日 2022.04.24 (71)申请人 上海科技大 学 地址 201210 上海市浦东 新区华夏中路393 号 申请人 上海交通大 学医学院附属瑞金医院 (72)发明人 刘佳　瞿介明　 (74)专利代理 机构 上海弼兴律师事务所 31283 专利代理师 水文钰　黄益澍 (51)Int.Cl. C12N 15/113(2010.01) C12N 9/22(2006.01) C12Q 1/6816(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12Q 1/70(2006.01)C12Q 1/6806(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 基于CRISPR的核酸检测试剂盒及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种基于CRISPR的检测试剂 盒及其应用。 本发明的检测试剂盒包含基因编辑 系统， 所述基因编辑系统包括核 酸酶和引导RNA； 所述引导RNA的序列选自如SEQ  ID NO:1～4所示 的核苷酸序列中的一种或多种。 本发 明的试剂盒 能够在缩短的反应时间、 降低的反应温度内提高 检测效率的同时降低检测限， 操作无核酸抽提、 免开盖， 简便快速 。 权利要求书2页 说明书8页 序列表3页 附图6页 CN 115029345 A 2022.09.09 CN 115029345 A 1.一种基因编辑系统， 其特 征在于， 所述基因编辑系统包括核酸酶和引导RNA； 其中， 所述引导RNA的序列选自如SEQ  ID NO:1～4所示的核苷酸序列中的一种或多种。 2.如权利要求1所述的基因编辑系统， 其特征在于， 所述引导RNA的序列如SEQ  ID NO:1 ～4任一项所示； 和/或， 所述核酸酶为Cas蛋白； 较佳地， 所述Cas蛋白为Cas12a或Cas13a； 更佳地， 所述Cas蛋白为AsCas12a、 BbCas12a、 BoCas12a、 FnCas12a、 HkCas12a、 Lb4Cas12a、 Lb5 Cas12a、 LbCas12a、 O sCas12a或TsCas12a。 3.一种分离的核酸， 其特 征在于， 所述核酸编码如权利要求1或2所述的基因编辑系统。 4.一种用于核酸检测的检测体系， 其特征在于， 所述检测体系包括基因编辑系统和反 应缓冲液； 其中， 所述基因编辑系统包括核酸酶和引导RNA， 所述反应缓冲液包括10～50mM 的NaCl、 5～50mM的MgCl2、 5～50mM的Tris ‑HCl、 0.1～1.0mM的二硫苏糖醇和50～200 μg/mL 的牛血清白蛋白， pH  7～8； 较佳地， 所述反应缓冲液包括20～30mM的NaCl、 15～25mM的MgCl2、 10～20mM的Tris ‑ HCl、 0.5～ 0.75mM的二硫苏糖醇和100～2 00 μg/mL的牛血清白蛋白， pH  7～8； 和/或， 所述核 酸酶为Cas蛋 白； 和/或， 所述引导RNA的工作浓度为50～200nM例如100nM， 所述核酸酶的工 作浓度为25～10 0nM例如5 0nM； 更佳地， 所述 反应缓冲液包括20mM的NaCl、 15mM的MgCl2、 10mM的Tris ‑HCl、 0.5mM的二硫 苏糖醇和100μg/mL的牛血清白蛋白， pH7.9； 和/或， 所述Cas蛋白为Cas12a或Cas13a； 所述 Cas蛋白优选为AsCas12a、 BbCas12a、 BoCas12a、 FnCas12a、 HkCas12a、 Lb4Cas12a、 Lb5Cas12a、 LbCas12a、 O sCas12a或TsCas12a。 5.一种用于核酸扩增的扩增体系， 其特征在于， 所述扩增体系包括引物、 RNase  H和RPA 酶； 其中， 所述引物用于扩增待测样品中的核酸， 所述 RPA酶为用于重组酶聚合酶扩增的酶； 所述RNase  H的浓度不高于1U/ μL； 较佳地， 所述RNase  H的浓度为0.1～0.5U/ μL； 所述引物为用于扩增SARS ‑CoV‑2的核酸 的引物； 和/或， 所述扩增体系还 包括逆转录酶； 更佳地， 所述引物为用于扩增 SARS‑CoV‑2的N基因的引物； 所述引物的正向引物优选选 自如SEQ ID NO:5～8所示的核苷酸序列中的一种或多种， 反向引物优选选自如SEQ  ID NO: 9～12所示的核苷 酸序列中的一种或多种； 和/或， 所述引物的工作浓度为0.2～2 μM例如0.4 μM。 6.一种用于病原裂解的裂解体系， 其特征在于， 所述裂解体系包括病原转移液和裂解 液； 所述病原转移液用于维持待测样品的病原活性， 所述裂解液用于暴露所述待测样品中 的病原核酸； 所述病原转移液优选包括0.8％氯化钠、 0.04％氯化钾、 0.014％氯化钙、 0.02％硫酸镁(七水)、 0.012％磷酸氢二钠(七水)、 0.006％磷酸二氢钾、 0.035％碳酸氢钠、 0.1％葡萄糖、 0.002％酚红钠盐； 所述百分比为质量百分比； 其中， 所述病原转移液与所述 裂解液的体积比为1:(0.5～10)； 较佳地， 所述病原转移液与所述裂解液的体积比为1:(1～5)； 和/或， 所述病原选自病 原性真菌、 病毒和病原性原核生物； 所述病原性原核生物优选包括细菌、 支 原体和衣原体； 更佳地， 所述病原转移液与所述裂解液的体积比为1:1； 和/或， 所述病原为病毒， 优选权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115029345 A 2地为RNA病毒， 例如SARS ‑CoV‑2、 IAV或IBV。 7.一种用于核酸检测的试剂 盒， 其特征在于， 所述试剂 盒包括如权利要求4所述的检测 体系； 较佳地， 所述基因编辑系统为如权利要求1或2所述的基因编辑系 统； 和/或， 所述检测 体系还包括核酸探针； 和/或， 所述试剂盒还包括扩增体系， 所述扩增体系包括扩增引物和 RPA酶； 其中， 所述扩增引 物用于扩增待测样品中的核酸， 所述RPA酶为用于 重组酶聚合酶扩增的酶； 和/或， 所述试剂盒还包括裂解体系， 所述裂解体系包括病原转移液和裂解液； 其中， 所述病原 转移液用于维持待测样品的病原活性， 所述裂解液用于暴露所述待测样品中的病原核酸； 更佳地， 所述扩增体系为如权利要求5所述的扩增体系； 和/或， 所述裂解体系为如权利 要求6所述的裂解体系； 和/或， 所述核酸探针为荧光标记的单链DNA； 所述荧光标记优选地包括分别位于所述单链DNA 两端的发光基团和 淬灭基团； 所述单链DNA的序列优选地为CCCCC； 例如， 所述发光基团为 FAM， 所述淬灭基团为BHQ1。 8.一种用于检测SARS ‑CoV‑2的crRNA， 其特征在于， 所述crRNA为检测SARS ‑CoV‑2的N基 因的crRNA； 其中， 所述crRNA选自如SEQ  ID NO:1～4所示的核苷酸序列中的一种或多种。 9.一种核酸检测的方法， 其特征在于， 所述方法包括： 使待测样品与如权利要求4所述 的检测体系发生反应， 收集所述反应产生的荧 光信号； 较佳地， 所述反应的时间为5～ 25min； 和/或， 所述反应的温度为3 5～45℃； 更佳地， 所述反应的时间为10～25min， 优选地为10～20min， 例如 为15～20min； 和/或， 所述反应的温度为3 5～42℃， 优选地 为37～42℃， 例如为39 ～42℃。 10.如权利要求9所述的方法， 其特征在于， 所述方法还包括在进行所述反应之前， 所述 待测样品中的核酸在如权利要求5所述的扩增体系中发生扩增； 和/或， 所述方法还包括在 进行所述反应之前， 所述待测样品使用如权利要求6所述的裂解体系进 行裂解， 以暴露所述 待测样品中的核酸； 较佳地， 所述扩增体系与所述检测体系的反应体积比为1:(1～5)； 和/或， 所述扩增体 系预存于发生所述检测反应的封闭容器内； 更佳地， 所述扩增体系与所述检测体系的反应体积比为1:(2～4)， 例如为1:3； 和/或， 所述检测体系在所述扩增结束后加入所述封闭容器内， 所述加入优选通过注射加入； 和/ 或， 所述裂解的温度为37℃～ 95℃， 例如为6 5℃～95℃。 11.一种如权利要求1或2所述的基因编辑系统、 如权利要求3所述的核酸、 如权利要求4 所述的检测体系、 如权利要求5所述的扩增体系、 如权利要求6所述的裂解体系、 如权利要求 7所述的试剂盒 或者如权利要求8所述的crRNA在制备检测病原核酸的试剂中的应用； 较佳地， 所述病原选自病原性真菌、 病毒和病原性原核生物； 所述病原性原核生物优选 包括细菌、 支 原体和衣原体； 更佳地， 所述病原为病毒， 优选为SARS ‑CoV‑2； 所述病原核酸优选为SARS ‑CoV‑2的N基 因。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115029345 A 3