(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 20221042549 9.5 (22)申请日 2022.04.22 (71)申请人 南京农业大 学 地址 210095 江苏省南京市玄武区卫岗1号 (72)发明人 王虎虎　张晋豪　刘欣悦　胡海静　 徐幸莲　 (74)专利代理 机构 南京天华专利代理有限责任 公司 32218 专利代理师 吴爽　徐冬涛 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/38(2006.01) C12R 1/39(2006.01)C12R 1/385(2006.01) (54)发明名称 一种用于多场景的肉品新鲜度快速检测引 物及其检测方法和应用 (57)摘要 一种可用 于多场景的肉品新鲜度快速检测 引物及其检测方法和应用， 属于食品检测技术领 域， 本发明选用假单胞菌基因组的保守序列作为 其特异性靶标， 设计了4条能扩增该基因的特异 性引物组， 通过可视化染料和OD646吸光值指示检 测结果， 由紫色 （阴性） 变为蓝色 （阳性） ， OD646超 过0.19为阳性。 将肉产品的新鲜度指标与该方法 检测结果相关联， 反应结果呈阳性 （蓝色）， 且 646nm处吸光度值超过0.19， 则认为样品已腐败， 若为紫色说明样品新鲜度较好。 该方法对假单胞 菌特异性好、 操作 简单， 无需复杂仪器， 结果易于 判读， 可以快速 （60分钟内） 特异地检测假单胞 菌， 进而在多种场景下指示肉品的新鲜度， 适合 肉品质检、 销售抽检和家庭购买产品的新鲜度检 测。 权利要求书2页 说明书8页 附图3页 CN 114561482 A 2022.05.31 CN 114561482 A 1.一种用于多场景的肉品新鲜度快速检测引物， 其特征在于： 以假单胞菌基因组的保 守序列为模板， 设计引物序列， 所述引物包括外引物和内引物， 所述外引物包括F3和B3， 所 述内引物包括FIP和BIP， 其序列具体如下： F3： CATCATG GCCCTTACGGC， 如SEQ  ID NO:1所示； B3： ACTCCCATGGTGTGACG G， 如SEQ ID NO:2所示； FIP： TTAGCTCCACCTCGCGGCTT‑GGGCTACACACGTGCTAC， 如SEQ  ID NO:3所示； BIP： AGTCTGCA ACTCGACTGCGTG ‑AAGGCCCGGGAACGTATT， 如SEQ ID NO:4所示。 2.一种用于多场景的肉品新鲜度 快速检测试剂 盒， 其特征在于： 包含权利要求1所述的 引物； 优选的， 所述试剂盒还包括： 2 ×LAMP 反应缓冲液、 Bst  2.0 WarmStartTM DNA聚合酶、 羟基奈酚蓝 （HNB） ； 更优选的， 所述2 ×LAMP 反应缓冲液包括： 40mM  Tris‑HCl、 100mM  KCl、 20mM (NH4)2SO4、 12mM MgSO4、 0.2% Tween‑20、 2mM dNTPs和pH  8.8。 3.一种用于多场景的肉品新鲜度快速检测方法， 其特 征在于： 该 方法步骤如下： 将肉样置 于无菌生理盐水中振荡， 得到 洗脱液； 提取洗脱液中细菌的基因 组作为LAMP反应 体系的扩增模板； 将 （2） 中得到的模板加入LAMP反应体系中恒温扩增后， 测定吸光度和裸眼观察体系的 颜色变化； 其中， 所述 LAMP反应 体系中含有权利要求1所述的引物。 4.根据权利要求3所述的一种用于多场景的肉品新鲜度快速检测方法， 其特征在于： 所 述步骤 （1） 中， 肉样与无菌生理盐水的质量比为1： 5 ‑9， 振荡洗脱肉品表面的菌体。 5.根据权利要求3所述的一种用于多场景的肉品新鲜度快速检测方法， 其特征在于： 步 骤 （2） 中细菌基因组为常规试剂盒提取或利用煮沸法提取， 即取1mL洗脱液于90 ‑100 ℃金 属浴下沸8 ‑10 min。 6.根据权利要求3所述的一种用于多场景的肉品新鲜度快速检测方法， 其特征在于： 所 述步骤 （3） 的LAMP反应体系包括： 2 ×LAMP 反应缓冲液、 Bst  2.0 WarmStartTM DNA聚合酶、 羟基奈酚蓝 （HNB） 和权利要求1中所述引物组； 优选的， 所述2 ×LAMP 反应缓冲液包括： 40mM  Tris‑HCl、 100mM  KCl、 20mM  (NH4)2SO4、 12mM MgSO4、 0.2% Tween‑20、 2mM dNTPs， pH  8.8； 更优选的， LAMP反应体系为10 ‑50μL： 1/2体积的2 ×LAMP反应缓冲液， 内引物FIP、 内引 物BIP、 外引物F3、 外引物B3、 染料羟基奈酚蓝 （HNB） 、 Bst  2.0Warmstart  DNA聚合酶和基因 组模板各1/25体积， 剩余体积用无酶水补齐。 7.根据权利要求3所述的一种可用于多场景的肉品新鲜度 快速检测方法， 其特征在于： 外引物F3和B3与内引物FIP和BIP的浓度比例为1:10 ‑30。 8.根据权利要求3所述的一种可用于多场景的肉品新鲜度 快速检测方法， 其特征在于： 步骤 （3） 中反应条件为61 ‑65 ℃恒温40 ‑70分钟。 9.根据权利要求3所述的一种可用于多场景的肉品新鲜度 快速检测方法， 其特征在于： 步骤 （3） 中取适量的LAMP反应液测定646nm处的吸光度； 优选的， 利用权利要求3 ‑8所述的 LAMP反应体系对样品DNA进行扩增， 反应结束后样品呈蓝色为阳性， 紫色为阴性； 以OD646为 0.19作为判定LAMP反应阳性的阈值， 超过 该值认定反应结果 为阳性。 10.权利要求1所述的引物、 或权利要求2所述的试剂盒、 或权利要求3 ‑9任一所述的检权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114561482 A 2测方法在检测假单 胞菌以指示肉品新鲜度中的应用。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114561482 A 3