(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210421628.3 (22)申请日 2022.04.21 (71)申请人 青岛市市立医院 地址 266000 山东省青岛市东海中路5号 (72)发明人 朱文静　步向阳　韩欢　石杰　 (74)专利代理 机构 北京卓岚智财知识产权代理 事务所 (特殊普通合伙) 11624 专利代理师 张旭东 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) G16B 25/00(2019.01) G16B 50/30(2019.01)G16H 50/30(2018.01) (54)发明名称 一组预测肝癌预后联合标志 物及其应用 (57)摘要 本发明公开了一组预测肝癌预后联合标志 物及其应用， 属于生物医药技术领域。 肝癌是世 界范围内最 常见的癌症相关死亡原因之一， 预后 极差， 识别其有效的预后生物标志物具有重要的 临床意义。 本发 明提出了一种基于联合生物标志 物对肝癌患者预后进行测定及其风险评估的模 型， 涉及的联合生物标记物包括： CDCA3， CDCA8， SSRP1， HN1以及KIF4A 。 本发明依据病例样本中联 合生物标志物的表达情况， 定量地计算其预后风 险评分， 根据患者的风险评分的中位值分为高、 低风险组， 结果低风险组患者的预后明显优于高 风险组患者， 并通过K ‑Mplot生存曲线、 ROC曲线 及患者的生存时间和状态验证预后生存模型的 准确性和特异性。 因此， 该预测模型对于肝癌的 患者的预后预测及靶向治 疗具有重要的意 义。 权利要求书1页 说明书7页 附图3页 CN 114592065 A 2022.06.07 CN 114592065 A 1.一组用于预测肝癌预后的联合生物标记物， 其特征在于， 所述联合生物标记物包括 CDCA3、 CDCA8、 HN1、 KIF4A以及S SRP1； 其中， 所述联合标志物由基因表达量与对应系数的乘积之和构成的Risk  score来表 征： Risk score＝0.3915*expression  of gene HN1‑0.3864*expression  of gene KIF4A‑ 0.2886*expression  of gene CDCA3+0.4415*expression  of gene CDCA8+0.8842* expression of gene SSRP1。 2.如权利要求1所述的预测肝癌患 者预后及肝癌靶向治疗的基因集， 其特征在于， 所述 的CDCA3、 CDCA8、 HN1、 KIF4A以及S SRP1分别表示各基因在肝癌 患者中的表达量。 3.如权利要求1所述的一组用于预测肝癌预后的联合生物标记物， 其特征在于， 包括如 下步骤： (1)从TCGA检索肝癌的和癌旁组织RNA ‑Seq的数据； (2)筛选存在差异的基因集： 采用GSEA功能富集分析， 以|NES|>1并且NOM  p‑val<0.05 为标准， 选取具有显著统计学差异的基因集， 用于确定肝癌治疗中有价值的标志性联合生 物标志物； NES代表归一化后的富集分析评分,NOM  p‑val代表校正后的p  value， 表征富集 结果的可信度； (3)单因素COX筛选差异基因集中影响预后的基因： 利用单因素Cox回归分析， 筛选出差 异基因集中影响肝癌 患者预后的基因； (4)多因素COX构建肝癌预后的风险模型： 从单因素Cox分析结果中筛选P<0.001的预后 基因， 采用多因素Cox回归分析建立预后模型， 最终筛选出CDCA3、 CDCA8、 SS RP1、 HN1、 KIF4A 构建预测肝癌患者预后的风险模型； 对 所选基因的表达水平进 行加权， 与多因素Cox回归分 析得到的回归系数进行线性积分， 风险评分＝0.3915*expression  of gene HN1‑0.3864* expression  of gene KIF4A‑0.2886*expression  of gene CDCA3+0.4415*expression  of  gene CDCA8+0.8842 *expression of gene SSRP1， 风险评分公式可用于计算每个肝癌患者 的风险值； (5)预后模型中基因的异常表达： 在TCGA及GEO数据库中， 采用配对以及非配对T检验， 分析CDCA3、 CDCA8、 S SRP1、 HN1和KIF4A在肝癌组织及正常组织中的表达量； (6)评估风险模型准确性： 使用ROC曲线和Kaplan –Meier(K‑M)曲线评估模型的准确性； 通过实时荧 光定量PCR在临床组织中验证模型中CDCA3、 CDCA8、 S SRP1、 HN1和KIF4A的表达； (7)统计分析： 数据显示 为平均值 ±SD/SEM， P值小于 0.05认为是统计学有差异。 4.如权利要求1所述的一组用于预测肝癌预后的联合生物标记物， 其特征在于， 所述步 骤(1)检索数据并处理RNA序列数据具体为： 从TCGA下载422例肝癌患者数据， 包括RNA ‑Seq 转录组数据和临床数据。 5.一组用于预测肝癌预后的标记物， 该标记物含有如权利要求1所述的一组用于预测 肝癌预后的联合 生物标记 物， 该标记物在制备辅助判断肝癌预后试剂盒中的应用。 6.一种辅助判断肝癌预后的试剂盒， 该试剂盒含有如权利要求1所述的一组用于预测 肝癌预后的联合 生物标记 物。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114592065 A 2一组预测肝癌预后联合标志物及其应用 发明领域 [0001]本发明属于生物医药领域， 具体涉及一组预测肝癌预后的联合标志物及其应用， 具体涉及一组新的转录因子家族E2F相关的基因集， 该基因集可以作为 肝癌的预后标志 物。 背景技术 [0002]肝癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一， 死亡人数在所有癌症中位居第三。 早期难 以发现， 70％以上的肝癌患者在晚期确诊， 因此， 肝癌患者的预后极差。 此外， 传统的可识别 的临床和病理症状在预测肝癌预后方面存在很大缺陷， 为了延长肝癌患者的总体存活率， 需要寻找更好发预测预后的新方法。 [0003]肝癌作为一种异质性疾病， 并非由单个基因或其产物所决定， 越来越多的文献报 道， 来自患者肿瘤组织的多基因预后特征比单基因更能准确 地预测癌症患者的预后， 特别 是mRNA的多基因预后特征比非编 码预后基因具有 更好的预后准确性， 可以提供更有效的个 体化治疗。 然而， 目前在肝癌中尚缺乏mRNA联合生物标志物对肝癌预后的研究。 因此， 寻找 有效的联合 生物标志 物对于评估肝癌的预后具有重要的意 义。 [0004]E2F是编码一系列转录因子、 具有多功能的转录因子家族。 目前已报道E2F家族可 通过结合共识DNA结合序列参与调控肿瘤细胞周期、 DNA损伤反应、 细胞分化和细胞死亡， 从 而影响肿瘤细胞的生长和侵袭。 大量的证据表明， 在多种癌症类型中， E2F通过控制其下游 的靶标因子参与肿瘤的发生 发展。 本发明公开的联合生物标志物可用于肝癌患者的预后判 断， 对我国肝癌的治疗与预后判断现状具有显著意 义。 发明内容 [0005]鉴于在预测肝癌预后的现有技术中缺乏足够的生物标志物， 本发明提供一组用于 预测肝癌预后的联合 生物标记 物及其确立方法和应用。 为实现该目的， 将进行如下说明： [0006]第一方面， 本发明提供了一组用于预测肝癌预后的联合生物标记物， 所述联合生 物标记物包括CDCA3， CDCA8， HN1， KIF4A以及SSRP1； 所述联合标志物由Risk  score表征： Risk score＝0.3915*expression  of gene HN1‑0.3864*expression  ofgene KIF4A‑ 0.2886*expression  ofgene CDCA3+0.4415*expression  ofgene CDCA8+0.8842* expression ofgene SSRP1。 [0007]第二方面， 本发明提供了将上述联合生物标记物用于预测肝癌预后的方法， 所述 方法包括如下步骤： [0008](1)从TCGA数据库， 检索肝癌患者的癌组织及癌旁组织的RNA ‑Seq测序数据， 并下 载患者的临床病理资料； [0009](2)利用GSEA功能富集分析， 筛选肝癌组织和癌旁正常组织中存在 差异的基因集： 采用GSEA功能富集分析， 以|NES|>1并且NOM  p‑val<0.05为标准， 选取具有显著统计学差异 的基因集， 用于确定肝癌治疗中有价值的标志 性联合生物标志物； NES代表归一化后的富集 分析评分， NOM  p‑val代表校正后的p  value， 表征富集结果的可信度； 其中， 转录因子E2F基说　明　书 1/7 页 3 CN 114592065 A 3