(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210424542.6 (22)申请日 2022.04.21 (71)申请人 黑龙江省农业科 学院经济作物研究 所 地址 150080 黑龙江省哈尔滨市南岗区学 府路368号 (72)发明人 高艳玲　范国权　白艳菊　张威　 张抒　程胜群　孙旭红　申宇　 马纪　邱彩玲　刘凯　 (74)专利代理 机构 哈尔滨市松花江专利商标事 务所 23109 专利代理师 李红媛 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01)C12N 15/11(2006.01) C12R 1/94(2006.01) (54)发明名称 用于检测苜蓿花叶病毒的引物及探针、 试剂 盒和应用 (57)摘要 用于检测苜蓿花叶病毒的引物及探针、 试剂 盒和应用， 它涉及检测领域。 本发明要解决目前 无法获取苜蓿花叶病毒(alfalfa  mosaic  virus,AMV)三分体基因组(RNA  1、 RNA 2、 RNA 3) 在虫体内以及马铃薯上的含量， 有针对性的进行 检测的问题。 本发明建立了AMVEvaGreen染料法 RT‑qPCR和TaqMan探针法RT ‑qPCR和RT ‑PCR检测 技术， 比较三者检测灵敏度， 建立标准曲线以检 测包含休眠块茎在内的马铃薯6个部位组织、 AMV 传播介体蚜虫及危害马铃薯的重要昆虫蓟马中 病毒含量。 旨在为种薯产业待茎尖剥离的候选块 茎、 种苗和各级种薯的检测与定量提供技术支 持。 权利要求书2页 说明书11页 序列表5页 附图3页 CN 115029481 A 2022.09.09 CN 115029481 A 1.用于检测苜蓿花 叶病毒的引物、 探针， 其特征在于所述的引物、 探针为RT ‑PCR引物、 EvaGreen染料法RT ‑qPCR引物或TaqMan探针法RT ‑qPCR引物及探针； 所述的RT ‑PCR引物为： 1‑970 F： CGAATCGAACGTAAGCAA； 1‑1290 R： ATGATTCGTTGAAGAAGATAA； 2‑812 F： ATGAAGCCGTCATATCAG GT； 2‑1054 R： TCAGATCGAT TCGACATG GA； 3‑1749 F： TACCGATTCAACGAAGTTT； 3‑1957 R： TATCAG GAGCGAATAGGACT； 所述的EvaGre en染料法RT ‑qPCR引物为： 1‑970 F： CGAATCGAACGTAAGCAA； 1‑1290 R： ATGATTCGTTGAAGAAGATAA； 2‑812 F： ATGAAGCCGTCATATCAG GT； 2‑1054 R： TCAGATCGAT TCGACATG GA； 3‑1522F： GTCTCACTGATGACGTGACG； 3‑1629R： CAAACCCGAACTTCTCATT； 所述的TaqMan探针法RT ‑qPCR引物及探针为： 1‑970 F： CGAATCGAACGTAAGCAA； 1‑1102 R： CCATTTGTCCTTTGACTCTAT T； 探针P1： 5`C Y5‑TTTGTCCCCAAGATGCCACAYTCC‑3` 2‑812 F： ATGAAGCCGTCATATCAG GT； 2‑1006 R： CAACCCATTCTTGAAAATACTT； 探针P2： 5`H EX‑TCAGGTAATGATTGGATGACGT TGG‑3`； 3‑1749 F F： TACCGATTCAACGAAGTTT 3‑1957 R： TATCAG GAGCGAATAGGACT； 探针P3： 5`6 ‑FAM‑AGCAGGGCCCCTCCGCAG‑3`。 2.如权利要求1所述的用于检测苜蓿花叶病 毒的引物、 探针的应用， 其特征在于利用所 述的检测苜蓿花叶病毒的RT ‑PCR引物、 EvaGreen染料法RT ‑qPCR引物或TaqMan探针法RT ‑ qPCR引物及探针 检测蓟马和/或蚜虫体内的苜蓿花叶病毒。 3.根据权利要求2所述的用于检测苜蓿花叶病 毒的引物、 探针的应用， 其特征在于利用 所述的检测苜蓿花叶病毒的RT ‑PCR引物、 EvaGreen染料法RT ‑qPCR引物或TaqMan探针 法RT‑ qPCR引物及探针 检测蚜虫体内的苜蓿花叶病毒的RNA  1和RNA 2。 4.根据权利要求2所述的用于检测苜蓿花叶病 毒的引物、 探针的应用， 其特征在于利用 所述的检测苜蓿花叶病毒的RT ‑PCR引物、 EvaGreen染料法RT ‑qPCR引物或TaqMan探针 法RT‑ qPCR引物及探针 检测蓟马体内的苜蓿花叶病毒的RNA  1。 5.如权利要求1所述的用于检测苜蓿花叶病 毒的引物、 探针的应用， 其特征在于利用所 述的检测苜蓿花叶病毒的RT ‑PCR引物、 EvaGreen染料法RT ‑qPCR引物或TaqMan探针法RT ‑ qPCR引物及探针 检测马铃薯内的苜蓿花叶病毒。 6.一种检测苜蓿花叶病毒的试剂盒， 其特征在于所述的试剂盒包括PCR反应液、权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115029481 A 2EvaGreen染料法qPCR反应液、 TaqMan法探针qPCR反应液， 含有AMV基因片段的重组质粒标准 品， 权利要 求1所述的RT ‑PCR引物、 EvaGreen染料法RT ‑qPCR引物或TaqMan探针法RT ‑qPCR引 物和探针； PCR反应液： 2 ×PCR Premix 12.5 μL、 10 μmol/L  RT‑PCR上下游引物各0.5 μL、 模板2 μL， 用无DNA/RNA酶去离 子水补至25 μL； EvaGreen染料法qPC R反应液:10 ×PCR缓冲液2 μL、 2.5mmol/L  dNTP 0.8 μL、 10 μmol/L上 下游引物各0.4 μL、 EvaGreen  1μL、 5U/ μL  Taq酶0.12 μL、 模板2 μL， 用无DNA/RNA酶去离子水 补至20 μL； TaqMan探针法qPCR反应液： 10 ×PCR缓冲液2 μL、 2.5mmol/L  dNTP 0.8 μL、 10 μmol/L上下 游引物和探针各0.4 μL、 5U/ μL  Taq酶0.12 μL、 模板2 μL， 用无DNA/RNA酶去离 子水补至20 μL。 7.根据权利要求6所述的一种检测苜蓿花叶病 毒的试剂盒， 其特征在于所述的含有AMV 基因片段的重组质粒标准品制备为： 应用权利要求1所述的3组RT ‑PCR引物和1组EvaGreen 染料法RT ‑qPCR引物针对AMV阳性样品进行RT ‑PCR扩增， 得到RNA  1、 RNA 2和2个RNA 3的扩 增产物， 分别与pEASY ‑T 5Zero载体连接， 转化到Trans  1‑T1感受态细胞中， 应用PCR法鉴定 阳性克隆子， 采用试剂盒提取重组质粒， 即得到含有AMV基因片段的重组质粒标准品； 所述 的3组RT‑PCR引物为1 ‑970 F/1‑1290 R、 2‑812 F/2‑1054 R、 3‑1749 F/3‑1957 R； 所述的1 组EvaGre en染料法RT ‑qPCR引物为3 ‑1522 F/3‑1629R。 8.根据权利要求6所述的一种检测苜蓿花 叶病毒的试剂盒， 其特征在于所述的RT ‑PCR 反应程序为： 95℃  3min； 95℃ 20s， 52℃ 20s， 72℃ 30s； 35个循环， 72℃  10min。 9.根据权利要求6所述的一种检测苜蓿花叶病毒的试剂盒， 其特征在于所述的 EvaGreen染料法RT ‑qPCR反应程序为： 9 5℃ 3min； 95℃ 25s， 52℃ 30s， 72℃  30s， 采集荧光 信号； 45个 循环， 60～97℃分析 熔解曲线， 40℃冷却。 10.根据权利要求6所述的一种检测苜蓿花叶病毒的试剂 盒， 其特征在于所述的TaqMan 探针法RT ‑qPCR反应程序为： 95℃  3min； 95℃  25s， 52℃  30s， 72℃  30s， 采集荧光信号； 45 个循环， 40℃冷却。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115029481 A 3