(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210420066.0 (22)申请日 2022.04.21 (71)申请人 河南农业大 学 地址 450000 河南省郑州市文化路95号 申请人 河南七度农业科技有限公司 　 北京博纳东方农业科技发展 有限公 司　 北京中研益农种苗科技有限公司 (72)发明人 贾芝琪　李纪锁　康东木　贾明朝　 张砚迪　李营　 (74)专利代理 机构 郑州三阳专利代理事务所 (普通合伙) 41175 专利代理师 袁宏伦 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01)C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 番茄ps-2基因的KAS P标记开发及应用 (57)摘要 本发明公开了番茄ps ‑2基因的KASP标记开 发及应用， 通过番茄材料选定， 番茄叶片DNA提 取， 使用KASP引物进行PCR扩增实现番茄ps ‑2基 因的KASP标记开发； 并对扩增产物的检测和分 析， 本发明番茄ps ‑2基因的KASP标记可用于番茄 ps‑2雄性不育基因的分子标记辅助育种； 对雄性 不育材料和雄性可育材料均能够准确地进行鉴 定， 在番茄雄性不育植株的筛选中具有较高的实 用性。 权利要求书1页 说明书4页 附图1页 CN 114703316 A 2022.07.05 CN 114703316 A 1.番茄ps‑2基因的KAS P标记开发， 其特 征在于， 包括： （1） 番茄材料选定： 纯合雄性不育材料MS7015和番茄材料P1059， ps ‑2基因定位于第4条染色体， 该基因和 ful基因连锁， 且ps ‑2番茄雄性不育基因为隐性单基因； （2） 番茄叶片DNA提取： 采用CTAB法从番 茄叶片中提取基因 组DNA； （3） 使用KAS P引物进行PCR扩增： KASP引物包括F3引物、 F4引物， F3引物的核苷酸序列为： Kps ‑2‑wild‑rfF3： GAAGGTGAC CAAGTTCATGCTCGTTAATTTATCGATACC， F4引物的核苷酸序列为： Kps ‑2‑mut‑shF4： GAAGGTCGG AGTCAACGGATTCGTTAATTTATCGATACG， 反向引物Kps ‑2R5： AATATTCAAATTTCTGATTCCACCA， 其中 Kps‑2‑wild‑rfF3和Kps ‑2‑mut‑shF4引物中GAAGGTGACCAAGTTCATGC序列和 GAAGGTCGGAGTCAACGGATT序列分别对应FAM荧 光标签和H EX荧光标签序列； 将提取的DNA分别加入 全裙边96孔板， 配制反应 体系进行PCR扩增反应。 2.根据权利 要求1所述的番茄ps ‑2基因的KASP标记开发， 其特征在于： 所述反应体系为 PCR反应体系： 反应体系总体积10ul， 其中2X  KASP Master mix： 5ul， KASP  Primer mix： 0.14ul， 模板DNA： 1ul， d dH20： 3.86ul； PCR反应程序： 94℃预变性15min； 94℃变性20s； 61 ‑55℃退火延伸60s， 10个循环； 94℃ 变性20s； 55℃退火延伸60s， 26个循环； PCR反应使用Applied  Biosystems  7500Real ‑Time  PCR System进行。 3.根据权利要求2所述的番茄ps ‑2基因的KASP标记开发， 其特征在于， 包括： 对扩增产 物的检测和分析： 使用Applied  Biosystems 7500Real ‑Time PCR System自带的软件对PCR 产物进行基因分型和数据分析。 4.根据权利 要求3所述的番茄ps ‑2基因的KASP标记开发的应用， 其特征在于： 用于番茄 ps‑2雄性不育基因的分子标记辅助育种。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114703316 A 2番茄ps‑2基因的KASP标记开发及应用 技术领域 [0001]本发明属于番 茄育种技 术领域， 特别涉及番 茄ps‑2基因的KAS P标记开发及应用。 背景技术 [0002]番茄味美、 营养丰富且具有保健功能， 在人们饮食结构中具有非常重要的地位。 番 茄栽培面积不断扩大， 已成为各地全年供应重要的蔬菜之一。 番茄杂种优势十分明显， 当前 番茄生产上全部使用杂交种子， 但目前番茄在杂交种子生产上， 大多仍然利用人工授粉进 行杂交制种， 不但费时、 费力制种成本高， 而且影响杂交种纯度。 [0003]番茄雄性不育类型都是隐性核不育， 番茄雄性不育系在利用上存在一定困难， 利 用雄性不育系进行育种时， 后代可育株与不育株发生分离。 利用早期标记性状， 幼 苗时期根 据标记性状鉴别不育株和可育株， 能解决原来两用系只有在开花时， 才能鉴别可育株的问 题。 不育系商品性状较差， 所以在实际应用中需将雄性不育基因进 行转育。 但普通的不育系 转育周期很长， 要通过杂交、 自交各重复多代才能转育成一个优良的雄性不育系。 因此， 如 何在早期有效鉴定可育株与不育株， 将直接影响其应用价 值。 发明内容 [0004]本发明之目的在于提供番茄ps ‑2基因的KASP标记开发及 应用， 解决现有技术中的 问题， 对雄性不育材料和雄性可育材料均能够准确 地进行鉴定， 在番茄雄性不育植株的筛 选中具有较高的实用性。 [0005]为实现上述目的， 本发明提供如下技术方案： 番茄ps ‑2基因的KASP标记开发， 包 括： （1） 番茄材料选定： 纯合雄性不育材料MS7015和番茄材料P1059， ps ‑2基因定位于第4条染色体， 该基 因和ful基因连锁， 且ps ‑2番茄雄性不育基因为隐性单基因； （2） 番茄叶片DNA提取： 采用CTAB法从番 茄叶片中提取基因 组DNA； （3） 使用KAS P引物进行PCR扩增： KASP引物包括F3引物、 F4引物， F3引物的核苷酸序列为： Kps ‑2‑wild‑rfF3： GAAGG TGACCAAGTTCATGCTCGTTAATTTATCGATACC， F4引物的核苷酸序列为： Kps ‑2‑mut‑shF4： GAAGG TCGGAGTCAA CGGATTCGTTAATTTATCGATA CG， 反向引物Kps ‑2R5： AATATTCAAATTTCTGATTCCACCA， 其中Kps ‑2‑wild‑rfF3和Kps ‑2‑mut‑shF4引物中GAAGGTGACCAAGTTCATGC序列和 GAAGGTCGGAGTCAACGGATT序列分别对应FAM荧 光标签和H EX荧光标签序列； 将提取的DNA分别加入 全裙边96孔板， 配制反应 体系进行PCR扩增反应。 [0006]优选的， 所述反应体系为PCR反应体系： 反应体系总体积10ul， 其中2X  KASP  Master mix： 5ul， KAS P Primer mix： 0.14ul， 模板DNA： 1ul， d dH20： 3.86ul； PCR反应程序： 94℃预变性15min； 94℃变性20s； 61 ‑55℃退火延伸60s， 10个循环；说　明　书 1/4 页 3 CN 114703316 A 3