(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210418242.7 (22)申请日 2022.04.20 (71)申请人 深圳市易基因科技有限公司 地址 518118 广东省深圳市坪 山区坑梓街 道秀新社区聚龙山A路深城投创意工 厂生命科 学园厂房B3 301 (72)发明人 王君文　胡琪　 (74)专利代理 机构 北京轻创知识产权代理有限 公司 11212 专利代理师 朱晓彤 (51)Int.Cl. C40B 50/06(2006.01) C12Q 1/6806(2018.01) C12Q 1/6869(2018.01) C12N 15/11(2006.01)C12Q 1/6886(2018.01) (54)发明名称 一种微量游离DNA甲基化建库方法、 试剂盒 及测序方法 (57)摘要 本发明涉及基因检测技术领域， 具体而言， 涉及一种微量游离DNA甲基化建库方法、 试剂盒 及测序方法。 该建库方法包括以下步骤： 提取并 分离游离DNA样本； 对游离DNA样本进行双末端酶 切修剪； 在游离DNA片段的5 ’端连接含有甲基化 和生物素修饰的接头序列； 对 连接接头序列的游 离DNA片段进行磁珠捕获和纯化； 采用亚硫酸盐 转化液对进行亚硫酸盐转化； 对亚硫酸盐转化后 的游离DNA片段进行二链延伸并进行PCR扩增， 得 到DNA甲基化文库。 该方法能够显著增加游离DNA 的CG检测位点数量， 对于CG位点的覆盖效果显 著。 相比于全基因组cfDNA甲基化测序， 测序深度 显著增加， 测序数据量更低， 成本更低。 权利要求书2页 说明书9页 序列表8页 附图1页 CN 114717662 A 2022.07.08 CN 114717662 A 1.一种微 量游离DNA甲基化建库方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 1)提取并分离游离DNA样本； 2)对所述游离DNA样本进行双末端酶切修剪， 得到游离DNA片段； 3)在所述游离DNA片段的5 ’端连接含有甲基化和生物素修饰的接 头序列； 4)采用磁珠对连接 接头序列的所述游离DNA片段进行捕获和纯化， 并得到产物； 5)采用亚硫酸盐转 化液对所述 步骤4)得到的产物进行亚硫酸盐转 化； 6)对亚硫酸盐转 化后的产物进行二链延伸； 7)对二链延伸的产物进行PCR扩增， 得到DNA甲基化文库。 2.根据权利 要求1所述一种微量游离DNA甲基化建库方法， 其特征在于， 所述步骤2)中， 双末端酶切修剪采用的酶为MspI、 AluI、 BstNI、 HpyCH4V、 HaeIII、 HpyCH4III、 ApekI、 BanII、 SphI、 BssSI、 BglII、 BamHI、 Kpn I中的一种。 3.根据权利要求1所述一种微量游离DNA甲基化建库方法， 其特征在于， 所述步骤3)中 的所述接 头序列为Ad1， 所述 步骤3)还 包括在所述游离DNA片段的3 ’端连接Ad2的步骤； 所述步骤5)中， 进行亚硫酸盐转化后， Ad2结合在磁珠上并与所述游离DNA片段分离， 连 接有Ad1的所述游离DNA片段转移至所述 亚硫酸盐转 化液中。 4.根据权利要求3所述一种微量游离DNA甲基化建库方法， 其特征在于， 所述接头序列 为基于Illumina平台设计的序列； 其中， Ad1的核苷酸序列如SEQ  ID NO 1.所示， Ad2的核苷酸序列如SEQ  ID NO 2.所示； 或， Ad1的核苷酸序列如SEQ  ID NO 3.所示， Ad2的核苷酸序列如SEQ  ID NO 4.所示。 5.根据权利要求3所述一种微量游离DNA甲基化建库方法， 其特征在于， 所述接头序列 为基于MGI平台设计的序列； 其中， Ad1的核苷酸序列如SEQ  ID NO 5.所示， Ad2的核苷酸序列如SEQ  ID NO 6.所示； 或， 中Ad1的核苷酸序列如SEQ  ID NO 7.所示， Ad2的核苷酸序列如SEQ  ID NO 8.所示。 6.根据权利要求1～5任意一项所述一种微量游离DNA甲基化建库方法， 其特征在于， 所 述步骤1)中提取并分离的游离DNA样本量 为0.3‑2ng。 7.根据权利要求1～5任意一项所述一种微量游离DNA甲基化建库方法， 其特征在于， 所 述步骤6)中， 进行二链延伸的试剂包括DNA聚合酶， 所述DNA聚合酶为T4  DNA Polymerase、 Bst DNA polymerase、 Klenow  Frgment(3 ’ ‑5’exo‑)、 PCR polymerase、 Hemo  KlenTaq (NEB)、 Amplitaq  DNA polymerase、 Stoffel  Fragment(Life)和NEB的 (exo–) DNA聚合酶、 DNA聚合酶中的一种。 8.根据权利要求1～5任意一项所述一种微量游离DNA甲基化建库方法， 其特征在于， 所 述步骤7)中， 对二链延伸的产物进行PCR扩增后， 还包括质量检测的步骤： 检测扩增后的产 物片段长度， 当产物片段长度为15 0bp‑300bp， 则得到的产物为DNA甲基化文库。 9.一种微量游离DNA甲基化建库试剂盒， 其特征在于， 用于如权利要求1～8任意一项所 述的微量游离DNA甲基化建库方法； 包括游离DNA样本的提取和分离试剂、 酶切试剂、 含有甲基化和生物素修饰的接头序 列、 接头序列连接试剂、 亚硫酸盐转 化试剂、 二链延伸试剂以及PCR扩增试剂。 10.一种游离DNA测序方法， 其特征在于， 先采用 如权利要求1～8任意一项所述的微量权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114717662 A 2游离DNA甲基化建库方法进行建库， 再进行测序。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114717662 A 3