(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210418633.9 (22)申请日 2022.04.20 (66)本国优先权数据 202110425613.X 2021.04.20 CN (71)申请人 江苏金斯瑞生物科技有限公司 地址 212000 江苏省镇江市镇江新区丁卯 经十五路9 9号54号楼 (72)发明人 范伟成　李秋成　禹坤　贺红军　 (74)专利代理 机构 北京市中伦律师事务所 11410 专利代理师 信建 (51)Int.Cl. C12N 15/70(2006.01) C12N 15/64(2006.01) C12N 1/21(2006.01)C12N 15/11(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (54)发明名称 一种克隆载体及其制备和用途 (57)摘要 本申请涉及一种克隆载体及其制备和用途。 所述克隆载体自5 ’至3’方向包含： (a)两个或更 多个终止子、 (b)一个或更多个操纵子的操纵区、 (c)克隆位点和/或目的基因， 和(d)两个或更多 个反向的启动子， 所述克隆载体为低拷贝数质粒 且包含操纵子阻遏蛋白表达元件。 权利要求书2页 说明书14页 序列表15页 附图6页 CN 115216484 A 2022.10.21 CN 115216484 A 1.一种克隆载体， 其自5 ’至3’方向包含： (a)两个或更多个终止子、 (b)一个或更多个操 纵子的操纵区、 (c)克隆位点和 /或目的基因， 和(d)两个或更多个反向的启动子， 所述克隆 载体为低拷贝数质粒且 包含操纵子阻遏蛋白表达元件。 2.根据权利 要求1所述的克隆载体， 其 中(a)的所述终止子包含T7终止子、 rrnB  T1终止 子和rrnB T2终止子。 3.根据权利要求1所述的克隆载体， 其中(b)的所述操纵子选自乳糖操纵子、 半乳糖操 纵子或阿拉伯糖操纵子 。 4.根据权利要求1或3所述的克隆载体， 其中所述克隆载体包含2个乳糖操纵子的操纵 区。 5.根据权利要求1所述的克隆载体， 其中(d)的所述启动子包括一个或更多个反向的 lac启动子和一个或更多个反向的T7启动子 。 6.根据权利要求1或5所述的克隆载体， 其中所述克隆载体包 含3个反向的lac启动子 。 7.根据权利要求1 ‑6中任一项所述的克隆载体， 其中所述克隆载体包含3个反向的T7启 动子。 8.根据权利要求1 ‑7中任一项所述的克隆载体， 其中所述克隆载体衍生自低拷贝数质 粒， 所述低拷贝数质粒选自以下中的一种： pET ‑21a、 pACYC184、 pBR332、 pB AD33、 pBBR1MCS和 pSC101。 9.根据权利要求1 ‑8中任一项所述的克隆载体， 其中所述克隆载体衍 生自pET‑21a。 10.根据权利要求1 ‑9中任一项所述的克隆载体， 其中所述克隆载体通过以下构建： 用 自5’至3’方向包含： (a)T7终止子、 rrnB  T1终止子和rrnB  T2终止子、 (b)2个乳糖操纵子的 操纵区、 (c)克隆位点和/或目的基因， 和(d)3个反向的lac启动子和3个反向的T7启动子的 序列替换pET ‑21a中的T7终止子、 6His标签、 T7标签、 凝血酶位点、 乳糖操纵子的操纵区和T7 启动子。 11.一种重组载体， 所述重组载体通过将待生产的核酸插入权利要求1至10 中任一项所 述的克隆载体而构建。 12.一种宿主细胞， 所述宿主细胞包含权利要求1至10 中任一项所述的克隆载体或权利 要求11所述的重组载体。 13.一种用于基因克隆的试剂盒， 其包含权利要求1至10中任一项所述的克隆载体、 权 利要求11所述的重组载体或权利要求12所述的宿主细胞。 14.权利要求1至10中任一项所述的克隆载体、 权利要求11所述的重组载体、 权利要求 12所述的宿主细胞或权利要求13所述的试剂盒用于生产核酸的用途。 15.一种生产核酸的方法， 所述方法包括： 将所述核酸插 入权利要求1至10中任一项所述的克隆载体， 将所述克隆载体转 化入合适的宿主细胞， 以及 在适合复制所述克隆载体的条件下培 养所述宿主细胞。 16.根据权利要求11所述的重组载体、 根据权利要求12所述的宿主细胞、 根据权利要求 13所述的试剂盒， 根据权利要求14所述的用途或根据权利要求15所述的方法， 其中所述核 酸为对宿主细胞有 毒性的基因。 17.根据权利要求16所述的方法， 其中所述核酸 为ccdB基因。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115216484 A 218.一种构建克隆载体的方法， 所述方法包括： 用自5 ’至3’方向包含： (a)T7终止子、 rrnB T1终止子和rrnB  T2终止子、 (b)2个乳糖操纵子的操纵区、 (c)克隆位点和/或目的基 因， 和(d)3个反向的lac启动子和3个反向的T7启动子的序列替换pET ‑21a中的T7终止子、 6His标签、 T7 标签、 凝血酶位 点、 乳糖操纵子的操纵区和T7启动子 。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115216484 A 3