(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210409834.2 (22)申请日 2022.04.19 (71)申请人 呼伦贝尔市公安局刑事侦查支队 地址 021000 内蒙古自治区呼伦 贝尔市河 西新区规划九街 申请人 无锡中德美联生物技 术有限公司 (72)发明人 孙树毅　额尔敦图 　李威　单晶　 鲁朦　胡曼　鞠欣　朱晨煦　 郭佳佳　姜颖烨　范晓芸　王皋　 葛毅晖　李惠钰　 (74)专利代理 机构 南京经纬专利商标代理有限 公司 32200 专利代理师 余俊杰 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01)C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/6844(2018.01) (54)发明名称 同时扩增马20个STR基因座的复合扩增试剂 盒及应用 (57)摘要 本发明公开了同时扩增马 20个STR基因座的 复合扩增试剂盒及应用， 所述试剂盒包括扩增以 下20个STR基因座的特异性扩增引物； 其中， 2 0个 STR基因座为： HTG6、 HTG7、 COR22、 CA425、 HTG4、 COR82、 LEX54、 COR69、 AHT5、 HMS3、 HMS1、 HMS6、 HMS7、 COR58、 HTG10、 ASB17、 VHL20、 HMS2、 ASB2、 LEX34。 与现有技术相比， 本发明具有以下优点： (1)所述试剂盒能够在单管中同时扩增、 检测20 个马STR位点， 为同类型产品中检测位点多的试 剂盒； (2)选用的基因座尽量分布在不同染色体 上， 相互之间不存在遗传连锁， 从而提高了试剂 盒的整体识别能力； (3)所述特异性扩增引物之 间相互无干扰， 无非特异峰产生， 且具有特异性 强、 分辨率高、 分型准确、 灵敏度高等特点， 可完 全满足马亲权鉴定、 个体识别、 性别辨别等多方 面需求。 权利要求书1页 说明书9页 序列表7页 附图3页 CN 114807385 A 2022.07.29 CN 114807385 A 1.同时扩增马20个STR基因座的复合扩增试剂 盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括扩增以 下20个STR基因座的特异性扩增引物； 其中， 20个STR基因座为： HTG6、 HTG7、 COR22、 CA425、 HTG4、 COR82、 LEX54、 COR69、 AHT5、 HMS3、 HMS1、 HMS6、 HMS7、 COR58、 HTG10、 ASB17、 VHL20、 HMS2、 ASB2、 LEX34。 2.根据权利要求1所述的同时扩增马20个STR基因座的复合扩增试剂盒， 其特征在于， 所述特异性扩增引物的序列如 下： HTG6、 SEQ  ID NO:1‑2； HTG7、 SEQ  ID NO:3‑4； COR22、 SEQ   ID NO:5‑6； CA425、 SEQ  ID NO:7‑8； HTG4、 SEQ  ID NO:9‑10； COR82、 SEQ  ID NO:11‑12； LEX54、 SEQ  ID NO:13‑14； COR69、 SEQ  ID NO:15‑16； AHT5、 SEQ  ID NO:17‑18； HMS3、 SEQ  ID  NO:19‑20； HMS1、 SEQ  ID NO:21‑22； HMS6、 SEQ  ID NO:23‑24； HMS7、 SEQ  ID NO:25‑26； COR58、 SEQ  ID NO:27‑28； HTG10、 SEQ  ID NO:29‑30； ASB17、 SEQ  ID NO:31‑32； VHL20、 SEQ   ID NO:33‑34； HMS2、 SEQ ID NO:35‑36； ASB2、 SEQ  ID NO:37‑38； LEX34、 SEQ  ID NO:39‑40。 3.根据权利要求1所述的同时扩增马20个STR基因座的复合扩增试剂盒， 其特征在于， 所述特异性扩增引物的浓度如下： HTG6、 0.2 μM； HTG7、 0.15 μM； COR22、 0.15 μM； CA42 5、 0.2 μM； HTG4、 0.25μM； COR82、 0.25μM； LEX54、 0.25μM； COR69、 0.25μM； AHT5、 0.25μM； HMS3、 0.2μM； HMS1、 0.15μM； HMS6、 0.2μM； HMS7、 0.25μM； COR58、 0.25μM； HTG10、 0.25μM； ASB17、 0.25μM； VHL20、 0.2 μM； H MS2、 0.2 μM； ASB2、 0.25 μM； LEX34、 0.2 μM 。 4.根据权利要求1所述的同时扩增马20个STR基因座的复合扩增试剂盒， 其特征在于， 所述特异性扩增引物分为5组， HTG6、 HTG7、 COR22、 CA42 5为第1组， HTG4、 COR82、 LE X54、 COR69 为第2组， AHT5、 HMS3、 HMS1、 HMS6为第 3组， HMS7、 COR58、 HTG10、 ASB17为第4组， VHL20、 HMS2、 ASB2、 LEX34 为第5组。 5.根据权利要求4所述的同时扩增马20个STR基因座的复合扩增试剂盒， 其特征在于， 所述特异性扩增引物采用荧光染料FAM、 HEX、 SUM、 LYN、 PUR 中的任一种进行标记， 且5组引物 采用的荧 光染料均不同， 内标选用橙色荧 光SIZ标记。 6.根据权利要求4所述的同时扩增马20个STR基因座的复合扩增试剂盒， 其特征在于， 每个基因座的特异性扩增引物中至少1条的5 ’端采用荧 光标记。 7.根据权利要求1所述的同时扩增马20个STR基因座的复合扩增试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括： 20个基因座的等位基因分型标准物、 反应混合液、 热启动Taq酶、 马基因组 DNA、 sdH2O和荧光分子量内标。 8.根据权利要求7所述的同时扩增马20个STR基因座的复合扩增试剂盒， 其特征在于， 所述反应混合液包括： MgCl2 8mM、 Tris ‑HCl 150mM、 KCl 150mM、 dNTPs  7.5mM、 BSA  2g/L。 9.权利要求1 ‑8任一所述同时扩增马20个STR基因座的复合扩增试剂盒在马亲权鉴定 或个体识别中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114807385 A 2同时扩增马20个STR基因座的 复合扩增试剂盒及应用 技术领域 [0001]本发明属于法医遗传学技术领域， 涉及一种马亲权鉴定和个体识别的方法， 具体 为同时扩增马20个STR基因座的复合扩增试剂盒及应用。 背景技术 [0002]马在动物分类学中的分类为： 脊椎动物亚门(Vertebrata)、 哺乳纲(Mammalia)、 奇 蹄目(Perissodactyl a)、 马科(E quidae)、 马属(E quus)、 马(E quus caballus)。 是一种草食 性动物。 现存家马和普氏野马两个亚种。 2011年末， 我国马的存栏数约为677万匹， 位居世界 第2位。 有地方品种29个， 培育品种13个， 已经形成育种群的引入品种有10个以上， 形成了丰 富多彩、 分布广阔的马种资源， 但其中2/3以上已经 处于数量下降、 濒 危或濒临灭绝状态。 我 国马种资源正处于保种和向非役用转型的关键时期 。 马在我国主要分布于四川、 新疆、 内蒙 等省(区)， 其中 内蒙2018年存栏数6 3.83万头， 位列全国第三。 [0003]短串联重复序列基因座(S hort Tandem Repeat， STR)作为继限制性片段长度多态 性之后的第二代遗传标记， 自二十世纪八九十年代以来， 被广泛应用于法医物证学方面相 关的研究及鉴定， 是目前应用最广泛的遗传标记之一。 STR标记与其他遗传标记物相比， STR 基因座片段小、 容易扩增， 更适用于微量和降解检材， 且多个STR基因座可以同时进行复合 扩增， 具有快速、 高效、 准确、 灵敏、 信息量大等优点， 被广泛应用于法医物证中的个体识别 和亲子鉴定 。 经研究报道发现， 该项技 术也可用于马亲权鉴定与个 体识别。 [0004]目前市场上针对马STR的商品化试剂盒仅有AB的Thermo  Scientifc  Bovine  Genotypes  Panel 3.1， 其为四色试剂盒， 包括17个STR位点((AHT4,AHT5,ASB2,ASB17, ASB23,CA425,HMS1,HMS2,HMS3,HMS6,HMS 7,HTG4,HTG6,HTG7,HTG10,LEX3  and VHL20)。 根 据其用户手册， 这些基因座选自FAO ‑ISAG所推荐的马微卫星位点， 所适用的也是马品种。 但 由于这些基因座只位于常染色体且数目不多， 不排除可能遇到等位基因型相同的两个个 体， 当两个 个体基因型相同时， 基因座数量少的试剂盒将无法区别两个 个体。 发明内容 [0005]解决的技术问题： 为了克服现有技术的不足， 实现在单管内同时扩增、 检测 马20个 STR基因座， 且在基因座排布中尽量使 各基因座分布于不同染色体上、 相互之间不存在遗传 连锁； 确保在扩增过程中各条引物之间相互无干扰， 无非特异峰产生， 从而满足马亲权鉴 定、 个体识别及性别辨别等多种需求。 鉴于此， 本发明提供了同时扩增马20个ST