(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210404980.6 (22)申请日 2022.04.18 (71)申请人 中国科学院苏州生物医学工程 技术 研究所 地址 215163 江苏省苏州市高新区科灵路 88号 申请人 苏州国科芯感医疗科技有限公司 (72)发明人 周连群　陶明丽　李金泽　张威　 郭振　张芷齐　李传宇　姚佳　 李超　周恒　 (74)专利代理 机构 北京三聚阳光知识产权代理 有限公司 1 1250 专利代理师 周淑歌 (51)Int.Cl. C12Q 1/6851(2018.01)C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/6858(2018.01) (54)发明名称 一种二维多重的检测基因突变的方法 (57)摘要 本发明涉及一种二维多重的检测基因突变 的方法， 属于分子生物学技术领域。 本发明提供 了一种二维多重的检测基因突变的方法， 同时使 用Blocker引物、 ARMS引 物和探针对待测样本进 行qPCR， 其中， Blocker引物以野生型为靶标， ARMS引物以突变型为靶标， 包括上游引物和下游 引物， 上游引物和下游引物的5 ’端连接有尾巴序 列， Blocker引物与上游引物在3 ’端有6～14个碱 基的重复。 所述方法的引物设计使得Blocker引 物与野生型模板优先结合从而阻断ARMS引物与 野生型模板的结合， 抑制野生型等位基因的扩 增， 而ARMS引物与突变 型模板结合从而 通过qPCR 富集突变型等位基因， 提高对突变位点的检测灵 敏度。 权利要求书1页 说明书6页 序列表2页 附图4页 CN 114908145 A 2022.08.16 CN 114908145 A 1.一种二维多重的检测基因突变的方法， 其特征在于， 所述方法同时使用Blocker引 物、 ARMS引物和探针对待测样 本进行实时荧光定量PCR； 所述Blocker引物以野生型为靶 标； 所述ARMS引物以突变型为靶标， 包括上游引物和下游引物； 所述上游引物和下游引物的5 ’ 端连接有尾巴序列； 所述Blocker引物与上游引物在3 ’端有6～14个碱基的重复； 所述突变 型的突变位 点位于上游引物3 ’端的第1个碱基位置处。 2.如权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述探针为互补荧光探针和/或Taqman荧光 探针。 3.如权利要求2所述的方法， 其特征在于， 当探针为互补荧光探针时， 所述上游引物的 5’端修饰有荧光基团， 所述互补荧光探针的3 ’端修饰有淬灭基团， 且所述互补荧光探针能 够与上游引物特异性结合。 4.如权利 要求2所述的方法， 其特征在于， 当探针为互补荧光探针时， 所述Blocker引物 的5’端修饰有荧光基团， 所述互补荧光探针的3 ’端或中间部分修饰有淬灭基团， 且所述互 补荧光探针能够与Bl ocker引物特异性结合。 5.如权利 要求1～4任一项所述的方法， 其特征在于， 所述Blocker引物的长度 为15～60 个碱基； 所述尾巴序列的长度为10～3 0个碱基。 6.一种用于检测基因突变的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒的成分包含Blocker引 物、 ARMS引物和探针； 所述Blocker引物以野生型为靶 标； 所述ARMS引物以突变型为靶 标， 包 括上游引物和下游引物； 所述上游引物和下游引物的5 ’端连接有尾巴序列； 所述Blocker引 物与上游引物在3 ’端有6～14个碱基的重复； 所述突变型的突变位点位于上游引物3 ’端的 第1个碱基位置处。 7.如权利要求6所述的试剂盒， 其特征在于， 所述探针为互补荧光探针和/或Taqman荧 光探针。 8.如权利要求7所述的试剂盒， 其特征在于， 当探针为互补荧光探针时， 所述上游引物 的5’端修饰有荧光基团， 所述互补荧光探针的3 ’端修饰有淬灭基团， 且所述互补荧光探针 能够与上游引物特异性结合。 9.如权利 要求7所述的试剂盒， 其特征在于， 当探针为互补荧光探针时， 所述Blocker引 物的5’端修饰有荧光基团， 所述互补荧光探针的3 ’端或中间部分修饰有淬灭基团， 且所述 互补荧光探针能够与Bl ocker引物特异性结合。 10.权利要求1～5任一项所述的方法或权利要求6～9任一项所述的试剂 盒在检测基因 突变中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114908145 A 2一种二维多重的检测基因 突变的方 法 技术领域 [0001]本发明涉及一种二维多重的检测基因突变的方法， 属于分子生物学技 术领域。 背景技术 [0002]基因突变(gene  mutation)是基因组DNA分子发生的突然的、 可遗传 的变异现象 (gene mutation)。 从分子水平上看， 基因突变是指基因在结构上发生碱基对组成或排列顺 序的改变。 基因虽然十分稳定， 能在细胞分裂时精确地复制自己， 但这种 稳定性是相对的。 在一定的条件下基因也可以从原 来的存在形式突然改变 成另一种新的存在形式， 就是在一 个位点上， 突然出现了一个新基因， 代替了原有基因， 这个 基因叫做突变 基因。 [0003]等位基因特异性扩增法(Amplification  Refractory  Mutation  System PCR， ARMS PCR)是一种能够用于检测基因突变的方法， 其原理是利用Taq  DNA聚合酶缺少3’ →5’ 外切酶活性， PCR引物的3 ’端末位碱基必须与其模板DNA互补才 能有效扩增的原理， 针对不 同的已知突变， 设计适当的引物以检测出突变基因。 该法在设计引物时， 在引物3 ’端设计一 错配碱基， 一个与野生DNA互补， 一个与突变DNA互补， 使之仅能与突变型或野生型 互补而只 扩增突变型或野生型基因， 扩增后的PCR产物可通过实时荧光定量PCR(real ‑time PCR)进 行定量分析。 与测序法相比， 使用等位基因特异 性扩增法检测基因突变具有快速、 成本相对 更低的优势； 与Taqman基因分型法相比， 使用等位基因特异性扩增法检测基因突变具有抑 制野生型扩增， 只扩增突变型， 使灵敏度更高的优势； 与水解探针法相比， 使用等位基因特 异性扩增法检测基因突变具有能实现一管多重， 更省时经济的优势。 [0004]然而， 等位基因特异性扩增 法目前尚未在基因突变检测领域被广泛应用， 这主要 是因为当野生型DNA序列被移除时， 诸如引物二聚体和 基因组其他部分的非特异性扩增的 序列没有被移除， 使得等位基因特异 性扩增法通常难以达到目标扩增效率。 因此， 亟需改进 等位基因特异性扩增法以推动其在基因突变 检测领域的大规模应用。 发明内容 [0005]为解决上述问题， 本发明提供了一种二维多重 的检测基因突变 的方法， 所述方法 同时使用Blocker引物、 ARMS引物和探针对待测样本进行实时荧光定量PCR； 所述Blocker引 物以野生型为靶标； 所述ARMS引物以突变型为靶标， 包括上游引物和下游引物； 所述上游引 物和下游引物的5 ’端连接有尾巴序列； 所述Blocker引物与上游引物在3 ’端有6～14个碱基 的重复； 所述 突变型的突变位 点位于上游引物3 ’端的第1个碱基位置处。 [0006]在本发明的一种实施方式 中， 所述探针为互补荧 光探针和/或Taqman 荧光探针。 [0007]在本发明的一种 实施方式中， 当探针为互补荧光探针时， 所述上游引物的5 ’端修 饰有荧光基团， 所述互补荧光探针的3 ’端修饰有淬灭基团， 且所述互补荧光探针能够与上 游引物特异性结合。 [0008]在本发明的一种实施方式中， 当探针为互补荧光探针时， 所述Blocker引物的5 ’端 修饰有荧光基团， 所述互补荧光探针的3 ’端或中间部分修饰有淬灭基团， 且所述互补荧光说　明　书 1/6 页 3 CN 114908145 A 3