(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210404541.5 (22)申请日 2022.04.18 (71)申请人 江西师范大学 地址 330022 江西省南昌市紫阳 大道99号 (72)发明人 戴嘉文　闫雪春　王倩　曾小刚　 黎泓波　 (74)专利代理 机构 郑州优盾知识产权代理有限 公司 41125 专利代理师 冉珊敏 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12Q 1/682(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 基于链置换和酶辅助循环信号放大的肿瘤 抑制因子Let-7a检测试剂盒及其使用方法 (57)摘要 本发明属于生物分析领域， 涉及基于链置换 和酶辅助循环信号放大的肿瘤抑制因子Let ‑7a 检测试剂盒。 在目标基因存在的时候， 通过链置 换反应， 辅助目标基因参与循环并使三链复合结 构中的荧光基团与猝灭基团远离从而释放荧光 信号， 同时置换下大量的A2单链， 随后A2单链通 过脚点介导的置换反应与DNA双链轨道Q+F中的 修饰有荧光团淬灭剂的DNA链杂交释放带有 开启 荧光的FA M修饰的DNA链， 随后 在加入的外切酶作 用下， 荧光团猝灭剂修饰的DNA链与A2链杂交， 可 以从其凹入的3端水解， 以循环再生A2链， 产生很 强的荧光信号。 荧光信号强度与目标基因浓度有 确定的关系， 从而实现对肿瘤抑制因子Let ‑7a的 灵敏检测。 权利要求书1页 说明书4页 附图2页 CN 114540503 A 2022.05.27 CN 114540503 A 1.基于链置换和酶辅助循环信号放大的肿瘤抑制因子Let ‑7a检测试剂盒， 其特征在 于： 包括A1链、 A 2链、 A3链、 Q链、 F链、 辅助探针、 缓冲液体系和外切酶EXO Ⅲ。 2.根据权利 要求1所述的肿瘤抑制因子Let ‑7a检测试剂盒， 其特征在于： 所述A 1链序列 为5’ ‑CAGAGACTCTCTACGCT ‑(FAM)–ACTAGGACTCT‑3’、 A2链序列为5 ’ ‑AGTAGGTTGTATAGTTTCC CTGCCATGGATCGACC ‑3’、 A3链为5 ’ ‑BHQ‑AGCGTAGAGAGTCTCTGGGGAAACTATACAACCTACTACCTCA ‑ 3’、 Q链序列为5 ’ ‑TCCATGGCAGGGAAACTATACAT ‑(BHQ)‑CCTACT‑3’、 F链序列为5 ’ ‑FAM‑ ATGTATAGTTTCCCTGCCATGGAGTATGA ‑3’、 辅助探针的序列为5 ’ ‑AGTAGGTTGTATAGTTTCCCCAGA GACTCTCTACGCTACGCAT ‑3’。 3.根据权利 要求2所述的肿瘤抑制因子Let ‑7a检测试剂盒， 其特征在于： 所述缓冲液体 系为pH=7的1   × NEB Buffer1， 其中含有10  mM Bis‑Tris‑Propane‑HCl、 10 mM MgCl2和1  mM DTT。 4.权利要求1 ‑3任一项所述的肿瘤抑制因子Let ‑7a检测试剂盒的使用方法， 其特征在 于， 步骤如下： （1） 配制A1链溶 液、 A2链溶液和A3链溶 液， 然后混匀经孵 育， 得多功能三链复合底 物； （2） 配制Q链溶 液和F链溶 液， 混匀后经孵 育， 得DNA双链Q+F； （3） 将步骤 （1） 中的多功能三链复合底物和待测液混合后， 依次加入辅助探针和缓冲液 体系， 孵育后 再加入步骤 （2） 中的DNA双链Q ‑F和外切酶EXO Ⅲ， 再孵育、 加热使外切酶EXO Ⅲ 失活并利用荧 光光度计收集 荧光信号； （4） 将步骤 （3） 的荧 光信号带入标准曲线计算待测溶 液中肿瘤抑制因子Let ‑7a的含量。 5.根据权利要求4所述的肿瘤抑制因子Let ‑7a检测方法， 其特征在于： 所述步骤 （1） 中 A1链溶液、 A2链溶液和A3链溶液的浓度均为10  μM， A1链溶液、 A2链溶液和A3链溶液的体积 比为1:1:1。 6.根据权利要求5所述的肿瘤抑制因子Let ‑7a检测方法， 其特征在于： 所述步骤 （2） 中Q 链溶液和F链溶 液的浓度均为10  μM， Q链溶 液和F链溶 液的体积比为1:1。 7.根据权利要求6所述的肿瘤抑制因子Let ‑7a检测方法， 其特征在于： 所述步骤 （1） 、 （2） 中孵化的条件为37℃金属浴中孵化2  h。 8.根据权利要求7所述的肿瘤抑制因子Let ‑7a检测方法， 其特征在于： 所述步骤 （3） 中 辅助探针的浓度为10  μM、 DNA双链Q ‑F的浓度为5 μM以及外切酶EXO Ⅲ的浓度为6 00 U/mL。 9.根据权利 要求7所述的肿瘤抑制因子Let ‑7a检测方法， 其特征在于： 所述收集荧光信 号时采用的激发波长为492  nm， 发射波长的检测范围为490nm ‑650nm， 扫描速度为1200nm/ min； 孵育、 加热的具体条件为37  ℃下孵育90min， 然后75℃加热20  min。 10.根据权利 要求9所述的肿瘤抑制因子Let ‑7a检测方法， 其特征在于： 所述步骤 （4） 中 标准曲线为y=1946 3.8396x+109619.3 636； R2=0.99041。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114540503 A 2基于链置换和酶辅助循环信号放大的肿瘤抑制因 子Let‑7a检 测试剂盒及其使用方 法 技术领域 [0001]本发明属于生物分析领域， 涉及基于链置换和酶辅助循环信号放大的肿瘤抑制因 子Let‑7a检测试剂盒及其使用方法。 背景技术 [0002]MicroRNA是一种非编码、 小片段 （约 20‑22基核苷酸长度） 、 单链的RNA分子， 在不同 的生理过程中起着 重要作用。 许多证据 表明， 作为一种新的基因调节因子， Micr oRNA可以抑 制基因的表达， 在哺乳动物体内microRNA参与调控超过60%的蛋白编码基因的活性， 并且 microRNA表达的改变与人体的生理机能紊乱， 尤其是肿瘤过程密切相关。 因此MicroRNA已 被选作许多疾病包括各种癌症早期诊断中的生物标志物。 Let ‑7 miRNA 家族有 12 个成 员， 其中， Let ‑7a 是重要的肿瘤抑制因子之一。 let ‑7a 的异常表达将导致多种癌症， 其低 表达与正常细胞的分化不良有关， 并可导致侵略性癌症的发展， 例如前列腺癌、 胃癌和宫颈 癌。 精确检测人体中某些  microRNA  的浓度， 这将有助于我们进一步了解某些癌症的发病 机理。 [0003]目前， 由于microRNA  的序列同源性强， 浓度低且易于降解， 想要实现对miRNA  的 高灵敏度检测并不容易。 检测miRNA的最 常用方法是North ern印迹杂交， RT ‑PCR和 miRNA微 阵列。 这些方法已成功应用于临床应用和其他基础研究中的  miRNA 检测， 但是Norther n印 迹杂交法灵敏度有限， 操作复杂， 需要放射性同位素标记， 严重破坏环境。 虽然RT ‑PCR和芯 片检测方法具有较高的检测灵敏度， 但其生产成本高或操作步骤复杂。 近年来， 核酸等 温扩 增由于其扩增速度快、 能有效提高传感器的灵敏度和准确性等优点而引起了人们对其引入 到 miRNA 检测中的研究兴趣。 扩增方法包括杂交链式反应、 滚环扩增反应、 双链特异性核 酸酶扩增和链置换扩增等。 同时各种信号放大技术与各种信号传感器相结合， 如荧光(FL)、 电化学发光(ECL)、 和表 面增强拉曼散射也被开 发用于高灵敏度的miRNAs测量。 在这些方法 中， 电化学方法耗时较长、 操作难度高且重 现性较差等一般性缺点； 而化学发光法需要额外 修饰活性物质且技术成本较高。 荧光光谱法因其测试操作简单、 成本低等优点而被广泛使 用。 因此开发一种荧光信号放大的灵敏检测低丰度microRNA的核酸生物传感器仍具有重要 意义。 专利CN105274194A描述了一种基于多重放大技术的肿瘤标志物 let7a的检测方法。 利 用磁珠连接的脱 氧核酶与目标物 let7a杂交后， 可以切断let7a； 利用切断后的产 物， 进行两 次剪切聚合的循环， 实现信号的放大； 利用剪切聚合后的产 物进行环介导放大反应， 嵌插荧 光试剂进行荧光检测， 可以计算let7a的浓度， 其检测限可达10‑18mol/L。 该专利通过磁珠回 收实现了较低的背景信号， 且在剪切酶和聚合酶的协同作用下使得信号循环放大， 最终实 现了生物传感器的高灵敏度检测， 但仍然存在操作复杂， 多种酶的使用导致缓冲液体系兼 容问题。 本申请利用熵驱动的链置换反应与外切酶的剪切特性， 避免了多种酶的同时使用， 操作简单， 可实现对目标的快速 灵敏检测。说　明　书 1/4 页 3 CN 114540503 A 3