(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210400613.9 (22)申请日 2022.04.16 (71)申请人 宁波大学 地址 315211 浙江省宁波市江北区风 华路 818号 (72)发明人 宋雪梅　郭俊明　谢瑶瑶　张双双　 俞秀冲　翁秋燕　 (74)专利代理 机构 宁波诚源专利事务所有限公 司 33102 专利代理师 徐雪波　叶桂萍 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01) (54)发明名称 检测血浆中tRF型胃癌分子标记物以及在制 备胃癌辅助诊断试剂盒的应用 (57)摘要 本发明涉及一种检测血浆中tRF型胃癌分子 标记物以及在制备胃癌辅助诊断试剂盒的应用， 其特征在于： 包括用于检测血浆样本中tRF ‑18‑ 79MP9P04、 tRF ‑30‑87R8WP9N1EWJ、 tRF ‑21‑ V2989UV3B以及 tRF‑33‑P4R8YP9LON4VDP的试剂， 与现有技术相比， 本发明的优点在于： 本发明的 试剂盒将tRF ‑18‑79MP9P04、 tRF ‑30‑ 87R8WP9N1EWJ、 tRF ‑21‑V2989UV3B以及tRF ‑33‑ P4R8YP9LON4VDP联合作为早期胃癌辅助诊断的 标志物， 能准确地完成靶标分子的绝对定量检 测， 及胃早癌的筛查与鉴别。 权利要求书2页 说明书8页 序列表1页 附图10页 CN 114875146 A 2022.08.09 CN 114875146 A 1.一种用于胃癌辅助诊断的检测试剂盒， 其特征在于： 包括用于检测血浆样本中tRF ‑ 18‑79MP9P04、 tRF ‑30‑87R8WP9N1EWJ、 tRF ‑21‑V2989UV3B、 tRF ‑33‑P4R8YP9LON4VDP的其中 一个或是四个联合的试剂， 其中： tRF‑18‑79MP9P04的核苷酸序列如SEQ  ID No.1所示， 所述tRF ‑18‑79MP9P04在胃早癌 患者血浆中显著下调； 所述引物为： F1： 5' ‑GTCCCTGTTGTGTTTCCGTAG  3'； R1： 5' ‑ GGTACCTCCTCTCTTCTCTACT ‑3'； tRF‑30‑87R8WP9N1EWJ的核苷酸序列如SEQ  ID No.2所示， 所述tRF ‑30‑87R8WP9N1EWJ 在胃早癌患者血浆中显著上调； F2： 5' ‑GTGTCCCTGGTGGTCTAGTGGTT ‑3'； R2： 5' ‑ GGTACCTCCTCTCTTCTCTACT ‑3'； tRF‑21‑V2989UV3B的核苷酸序列如SEQ  ID No.3所示， 所述tRF ‑21‑V2989UV3B在胃早 癌患者血浆中显著上调； F3 ： 5 ' ‑CGTTGGTAGGATGGGGTGTGA ‑3 '； R3 ： 5 ' ‑ GGTACCTCCTCTCTTCTCTACT ‑3'； tRF‑33‑P4R8YP9LON4VDP的核苷酸序列如SEQ  ID No .4所示， 所述RF ‑33‑ P4R8YP9LON4VDP在胃早癌患者血浆中显著下调； F4： 5' ‑GCATGGGTGGTTCAGTGGTAGA ‑3'； R4： 5'‑GGTACCTCCTCTCTTCTCTACT ‑3'。 2.根据权利要求1所述的用于胃癌辅助诊断的检测试剂 盒， 其特征在于： 所述试剂 盒还 包括有tRF ‑18‑79MP9P04、 tRF ‑30‑87R8WP9N1EWJ、 tRF ‑21‑V2989UV3B以及tRF ‑33‑ P4R8YP9LON 4VDP的逆转录引物序列， 其中， tRF‑18‑79MP9P04的逆转录序列如SEQ  ID No.5所示： 5' ‑GCAGACGAGGGTACCTCCTCTCTT CTCTACTCGTGTC CTACCCTCGTCTGC CCACTA‑3'； tRF‑30‑87R8WP9N1EWJ的逆转录序列如SEQ  ID No.6所示： 5' ‑GCAGACGAGGGTACCTCCTC TCTTCTCTACTCGTGTC CTACCCTCGTCTGCGC CGAA‑3'； tRF‑21‑V2989UV3B的逆转录序列如SEQ  ID No.7所示： 5' ‑GCAGACGAGGGTACCTCCTCTCT TCTCTACTCGTGTC CTACCCTCGTCTGCTAC CTA‑3'； tRF‑33‑P4R8YP9LON4VDP的逆转录序列如SEQ  ID No.8所示： 5' ‑ACAGACGAGGGTACCTCC TCTCTTCTCTACTCGTGTC CTACCCTCGTCTGTCAG GCG‑3'。 3.根据权利要求1或2所述的用于胃癌辅助诊断的检测试剂盒， 其特征在于： 所述试剂 盒还包括有tRF ‑18‑79MP9P04、 tRF ‑30‑87R8WP9N1EWJ、 tRF ‑21‑V2989UV3B以及tRF ‑33‑ P4R8YP9LON 4VDP的探针引物序列， 其中， tRF‑18‑79MP9P04的 探针 引物序列如SEQ  ID No .9所示 ： 5 ' ‑FAM‑ TGTCCTACCCTCGTCTGC CCACTA‑TAMRA‑3'； tRF‑30‑87R8WP9N1EWJ的探针引物序列如SEQ  ID No .10所示： 5 ' ‑FAM‑ GGATTCGGCGCAGACGAG GGTAGGA‑TAMRA‑3'； tRF‑21‑V2989UV3B的探针引物序列如SEQ  ID No .11所示 ： 5 ' ‑FAM‑ AGGTAGCAGACGAG GGTAGGACAC‑TAMRA‑3'； tRF‑33‑P4R8YP9LON4VDP的探针引物序列如SEQ  ID No .12所示： 5 ' ‑FAM‑ TTCTCGCCTGACAGACGAG GGTAGGA‑TAMRA‑3'。 4.一种检测血浆中tRF分子标记物的方法， 其特征在于， 所述tRF分子标记物为权利要 求1中所述的tRF ‑18‑79MP9P04、 tRF ‑30‑87R8WP9N1EWJ、 tRF ‑21‑V2989UV3B以及tRF ‑33‑权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114875146 A 2P4R8YP9LON 4VDP， 所述的方法包括如下步骤： (1)采集血 液， 提取血浆中的总RNA； (2)将总RNA逆转录成cDNA； (3)利用tRF ‑18‑79MP9P04、 tRF ‑30‑87R8WP9N1EWJ、 tRF ‑21‑V2989UV3B以及tRF ‑33‑ P4R8YP9LON4VDP的特异性扩增引物对步骤(2)的cDNA溶液进行荧光定量PCR检测， 反应结束 后检测荧 光信号值并设定 Y值； (4)获得每个样品的Cq值， 也就是y值， 并按所检测t RF对应的标准曲线计算出相应的拷 贝数x后， 将按照400 ×10x/3计算每个样品对应1mL血浆时的拷贝数， 并进行早期胃癌患者 1mL血浆内tRF ‑18‑79MP9P04、 tRF ‑30‑87R8WP9N1EWJ、 tRF ‑21‑V2989UV3B、 tRF ‑33‑ P4R8YP9LON 4VDP拷贝数的统计学分析。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114875146 A 3