(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210399331.1 (22)申请日 2022.04.15 (71)申请人 江苏省淡水 水产研究所 地址 210017 江苏省南京市 茶亭东街79号 (72)发明人 钟立强　王明华　陈校辉　张世勇　 姜虎成　 (74)专利代理 机构 江苏德善律师事务所 3248 8 专利代理师 赵鹏 (51)Int.Cl. C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/6869(2018.01) (54)发明名称 一种分子鉴别斑点叉尾鮰和云斑鮰的引物 及方法 (57)摘要 本发明提供一种分子鉴别斑点叉尾鮰和云 斑鮰的引物及方法， 引物的核苷酸序列如SEQ   NO:1和SEQ  NO:2或SEQ NO:3和SEQ  NO:4所示。 本 发明从细胞色素氧化酶亚基I基因、 细胞色素b基 因进行斑点叉尾鮰等相似鱼类的鉴定， 利用上述 引物通过线粒体基因组DNA条形码技术能够快速 便捷准确可靠地鉴别这两种鱼类， 该引物及方法 能够快速便捷准确可靠地对斑点叉尾鮰、 云斑鮰 等进行鉴别， 结果稳定性好， 重复率高， 填补了目 前国内分子生物学标准鉴别斑点叉尾鮰和云斑 鮰和黄颡鱼的空白， 将在生态资源调查和鱼类品 种鉴定中发挥重要作用， 具有广泛的应用前 景。 权利要求书1页 说明书5页 附图1页 CN 114836414 A 2022.08.02 CN 114836414 A 1.一种分子鉴别斑点叉尾鮰和云斑鮰的引物,其特征在于： 引物的核苷酸序列如SEQ   NO:1和SEQ  NO:2或SEQ  NO:3和SEQ  NO:4所示。 2.如权利要求1所述的分子鉴别斑点叉尾鮰和云斑鮰的引物,其特征在于： 所述SEQ   NO:1和SEQ NO:2用于鉴别斑点叉尾鮰、 云斑鮰和黄颡鱼； 所述SEQ  NO:3和SEQ  NO:4用于鉴 别斑点叉尾鮰 和云斑鮰。 3.用权利要求1所述的引物进行分子鉴别的方法,其特 征在于： 包括以下内容， （1） 分别提取待鉴定的斑点叉尾鮰和云斑鮰、 黄颡鱼基因组DNA， 以提取的基因组DNA为 模板， 用引物SEQ  NO:1和SEQ  NO:2进行PCR扩增， 扩增产物纯化后测序， 对斑点叉尾鮰、 云斑 鮰和黄颡鱼扩增产物序列比对， 细胞色素氧化酶亚基I基因序列的第325 ‑339位点碱基为 (CTC)3(CTG)2重复序列， 编码氨基酸为LLLLL的是云斑鮰， 碱基为TTC(CTG)2(CTA)2重复序 列， 编码氨基酸为FLLLL的是黄颡鱼， 碱基为TTCCTACTTCTGCTC序列， 编码氨基酸为FLLLL的 是斑点叉尾鮰； 或者， （2） 分别提取待鉴定的斑点叉尾鮰和云斑鮰基因组DNA， 以提取的基因组DNA为模 板， 用引物SEQ  NO:3和SEQ  NO:4进行PCR扩增， 扩增产物纯化后测序， 对斑点叉尾鮰和云斑 鮰扩增产物序列比对， 细胞色素b基因序列的第562 ‑573位点碱基 为(ATC)2(GCA)2重复序列， 编码氨基酸为IIAA的是斑点叉尾鮰； 碱基为(GTT)2GCGGCA重复序列， 编码氨基酸为VVAA的 是云斑鮰。 4.根据权利要求3所述的方法， 其特征在于： 所述的PCR反应体系为50  mL： 50ng/μL的 模板DNA 1 mL， PCR缓冲液  5 mL， dNTP混合液4  mL ， 每种dNTP  0.1mmol/L，  10 μmol/L的 上、 下游引物各 1 mL， 2mL 2 IU 的Taq酶； 双蒸水36mL； 所述的PCR缓冲液由10mmol/L  Tris‑ HCl， pH9.0，  0.5mmol/L KCl， 30mmol/L MgCl2， 0.01%明胶组成。 5.根据权利要求3所述的方法， 其特征在于： 方法 （1） 中， PCR扩增 反应程序为： 94  ℃预 变性2 min， 94 ℃变性45  s， 55℃退火1  min， 72 ℃延伸1 min， 经30个循环后再72  ℃延伸 10 min。 6.根据权利要求3所述的方法， 其特征在于： 方法 （2） 中， PCR扩增 反应程序为： 94  ℃预 变性2 min， 94 ℃变性45  s， 60℃退火1  min， 72 ℃延伸1 min， 经30个循环后再72  ℃延伸 10 min。 7.一种用于斑点叉尾鮰和云斑鮰的鉴别试剂 盒， 其特征在于， 所述试剂 盒包含引物SEQ   ID NO:1—SEQ  ID NO:4中的一种或几种。 8.根据权利要求7 所述的试剂盒， 其特 征在于： 所述试剂盒还 包括PCR扩增试剂。 9.氨基酸序列FL LLL在鉴别斑点叉尾鮰 和黄颡鱼中的应用。 10.根据权利要求9所述的应用， 其特征在于： 氨基酸序列FLLLL对应于细胞色素氧化酶 亚基I基因序列的第325 ‑339位点， 当碱基为TTC(CTG)2(CTA)2重复序列， 是黄颡鱼， 碱基为 TTCCTACTTCTGCTC序列， 是斑点叉尾鮰。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114836414 A 2一种分子鉴别斑点叉尾鮰和云斑鮰的引物及方 法 技术领域 [0001]本发明属于分子生物学技术领域， 具体涉及一种分子鉴别斑点叉尾鮰和云斑鮰的 引物及方法。 背景技术 [0002]斑点叉尾鮰  (Ictalures  punctatus )和云斑鮰( Ameiurus  nebulosus )都产于北 美， 是大型的鲇形目鱼类， 上世纪80年引先后入我国试养， 相继突破了养殖、 繁殖、 饲料、 加 工出口等环 节技术难关， 产量和养殖面积不断扩大， 成为我国主 要的鲇形目养殖鱼类之一。 [0003]斑点叉尾鮰和云斑鮰都是无鳞的鲇形目鱼类， 形态较为相似， 栖息水域也相同， 尤 其是幼鱼阶段， 仅通过形态和颜色难以鉴别， 做成鱼类制品后更是难以准确 鉴定。 此外， 斑 点叉尾鮰和云斑鮰的广泛养殖， 造成了一定的逃逸， 对我国水域生态和本土鱼类造成了一 定的破坏。 作为重要的出口特色鱼类， 斑点叉尾鮰和云斑鮰是我国主要 出口美国的品种， 美 国监管部门要求出口鱼类制品准确标注物种名称， 这也对两种鱼类的准确鉴别提出了严格 要求。 因此， 亟 待一种快捷方便、 准确可靠的鉴别斑点叉尾鮰 和云斑鮰的方法。 发明内容 [0004]为了克服现有技术中存在的不足， 本发明提供一种分子鉴别斑点叉尾鮰和云斑鮰 的引物及方法。 [0005]为实现上述目的， 本 发明提供一种分子鉴别斑点叉尾鮰和云斑鮰的引物,其中： 引 物的核苷酸序列如SEQ  NO:1和SEQ  NO:2或SEQ  NO:3和SEQ  NO:4所示。 [0006]优选的， 所述SEQ  NO:1和SEQ  NO:2用于鉴别斑点叉尾鮰、 云斑鮰和黄颡鱼； 所述 SEQ NO:3和SEQ  NO:4用于鉴别斑点叉尾鮰 和云斑鮰。 [0007]作为本发明的另一方面， 本发明提供一种进行分子鉴别的方法,其特征在于： 包括 以下内容， （1） 分别提取待鉴定的斑点叉尾鮰和云斑鮰、 黄颡鱼基因组DNA， 以提取的基因组 DNA为模板， 用引物SEQ  NO:1和SEQ  NO:2进行PCR扩增， 扩增产物纯化后测序， 对斑点叉尾 鮰、 云斑鮰和 黄颡鱼扩增产物序列比对， 细胞色素氧化酶亚基I基因序列的第325 ‑339位点 碱基为(CTC)3(CTG)2重复序列， 编码氨基酸为LLLLL的是云斑鮰， 碱基为TTC(CT G)2(CTA)2重 复序列， 编码氨基酸为FLLLL的是黄颡鱼， 碱基为TTCCTACTTCTGCTC序列， 编码氨基酸为 FLLLL的是斑点叉尾鮰； 或者， （2） 分别提取待鉴定的斑点叉尾鮰和云斑鮰基因组D NA， 以提取的基因组D NA 为模板， 用引物SEQ  NO:3和SEQ  NO:4进行PCR扩增， 扩增产物纯化后测序， 对斑点叉尾鮰和 云斑鮰扩增产物序列比对， 细胞色素b基因序列的第 562‑573位点碱基为(ATC)2(GCA)2重复 序列， 编码氨基酸为IIAA的是斑点叉尾鮰； 碱基为(GTT)2GCGGCA重复序列， 编码氨基酸为 VVAA的是云斑鮰。 [0008]优选的， 所述的PCR反应体系为50  mL： 50ng/μL的模板DNA  1 mL， PCR缓冲液  5 说　明　书 1/5 页 3 CN 114836414 A 3