(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210396181.9 (22)申请日 2022.04.15 (71)申请人 贵州省旱 粮研究所(贵州省高粱研 究所)(贵州省玉米 工程技术研究中 心) 地址 550025 贵州省贵阳市花溪区贵州省 农科院院内 申请人 贵州大学 (72)发明人 张立异　冯周　丁延庆　任明见　 李魁印　徐建霞　曹宁　 (74)专利代理 机构 重庆信必达知识产权代理有 限公司 5 0286 专利代理师 刘竹 (51)Int.Cl. C12N 15/29(2006.01)C07K 14/415(2006.01) C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/10(2006.01) C12Q 1/6806(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种控制高粱籽粒形状的基因及其分离、 克 隆方法与应用 (57)摘要 本发明属于分子生物学技术领域， 公开了一 种控制高粱籽粒形状的基因及其 分离、 克隆方法 与应用， 基因为SbGS ‑7， 所述高粱籽粒形状包括 圆粒粒形和长粒粒形； 其中， 所述控制高粱籽粒 圆粒粒形基因的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 1所 示， 所述控制高粱籽粒长粒粒形基因的核苷酸序 列如SEQ ID NO： 2所示。 本发明分离和克隆一种 能够控制高粱籽粒粒形(长/圆粒)的基因SbGS ‑ 7， 提供与粒形关联的分子标记M3， 用于鉴定高粱 中是否含有长/圆粒基因SbGS ‑7。 本发明利用该 标记在苗期即可进行长/圆粒基因型的分子标记 辅助选择， 保证100％准确率， 大大减少田间种植 材料的数量， 节省人力物力和财力， 加快高粱粒 形性状育种进程。 权利要求书2页 说明书10页 序列表5页 附图15页 CN 114921472 A 2022.08.19 CN 114921472 A 1.一种控制高粱籽粒形状的基因， 其特征在于， 所述控制高粱籽粒形状的基因为SbGS ‑ 7， 所述高粱籽粒形状包括圆粒粒形和长粒粒形； 其中， 所述控制高粱籽粒圆粒粒形基因的 核苷酸序列为SEQ  ID NO： 1， 所述控制高粱籽粒长粒粒形基因的核苷酸序列为SEQ  ID NO： 2。 2.一种如权利要求1所述控制高粱籽粒形状的基因编码的蛋白质， 其特征在于， 所述控 制高粱籽粒圆粒粒形基因编码的蛋白质氨基酸序列为SEQ  ID NO： 3， 所述控制高粱籽粒长 粒粒形基因编码的蛋白质氨基酸序列为SEQ  ID NO： 4。 3.一种应用如权利要求1所述控制高粱籽粒形状的基因得到的高粱长/圆粒粒形基因 SbGS‑7的功能分子标记， 其特征在于， 所述高粱长/圆粒粒形基因SbGS ‑7的功能分子标记M3 的获取方法， 包括： 根据第7个内含子内的第1828位碱基处包含 的10个碱基的插入/缺失特性开发得到基 于PCR技术的鉴定长/圆粒粒形基因SbGS ‑7的功能分子标记M3， 以高粱为对象， 所述分子标 记选自SEQ  ID NO： 5的引物对， 其中的核苷酸序列为5 ′ →3′。 4.一种应用如权利要求3所述高粱长/圆粒粒形基因SbGS ‑7的功能分子标记鉴定高粱 长/圆粒粒形基因SbGS ‑7的方法， 其特征在于， 所述鉴定高粱长/ 圆粒粒形基因SbGS ‑7的方 法， 包括： (1)通过常规PCR方法扩增、 测序和序列拼接， 获得高粱长/圆粒粒形基因SbGS ‑7的序 列； (2)利用多序列比对软件工具以及NCBI在线Blast， 将步骤(1)所获得的序列进行比对， 得到高粱长/圆粒基因SbGS ‑7的外显子序列所具有的特异7 处碱基差异， 这些差异 位于该基 因的第1和2外显子内， 在 进行翻译时， 除其中3处为同义突变外， 其余4处包括2处插入/缺失 和2处非同突变， 导致功能特异性氨基酸的改变， 最终影响高粱的粒形， 内含子序列所具有 的特异7处碱基差异， 这些差异位于该基因的第1、 4和7内含子内， 包括4处插入/缺失和2处 碱基突变。 根据第7个内含子内长粒粒形和圆粒粒形品种所具有的10个碱基的差异， 开 发M3 功能分子标记； (3)证实SbGS ‑7基因的功能分子标记在检测籽粒粒形的有效性， 对步骤(2)所获得的序 列在高粱自然群体中进 行验证； 根据长宽比表型选择长粒形株系共2 4个， 圆粒形株系25个， 特异性条带统计结果与49个株系籽粒长宽比性状完全一致， 正确率为100％， 由此确定 SbGS‑7基因的功能分子标记适用性较强。 5.如权利要求4所述鉴定高粱长/圆粒粒形基因SbGS ‑7的方法， 其特征在于， 步骤(1) 中， 所述PCR扩增反应 体系， 包括： 高粱基因组DNA  1ul， 正反向引物各1ul， Takara  Ex Taq 0.2ul， 10 ×Ex Buffer2ul， dNTP即2mM  2ul， dd H2O 12.8ul， 总体积20ul； 反应在BIO ‑RAD T100TM Thermal cyclerPCR仪进行扩增， 反应流程如下： 94℃预变性5 分钟； 94℃3 0秒、 59℃3 0秒、 72℃3 0秒， 35个循环； 72℃5分种； 4℃保存。 6.如权利要求5所述鉴定高粱长/圆粒粒形基因SbGS ‑7的方法， 其特征在于， 所述正反 向引物浓度各为10pmo l/L。 7.如权利要求4所述鉴定高粱长/圆粒粒形基因SbGS ‑7的方法， 其特征在于， 步骤(2) 中， 所述多序列比对软件工具， 包括MegAl ign和DNAMAN软件。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114921472 A 28.如权利 要求4所述鉴定高粱长/圆粒粒形基因SbGS ‑7的方法， 其特征在于， 所述SbGS ‑ 7基因功能分子标记的基因型分型 方法， 包括： 扩增的PCR产物在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的条带差异， 鉴别出每个待测高粱的基因型， 即鉴定出属于纯合长粒 形和纯合圆粒 形基因型中的哪种类型。 9.一种应用如权利要求1所述控制高粱籽粒形状的基因 的基因分离、 克隆方法， 其特征 在于， 所述控制高粱籽粒 形状的基因分离、 克隆方法， 包括： 通过全基因组关联分析GWAS扫 描多年多点 高粱的长宽比性状， 在第7染色体39.83kb的 连锁不平衡热点区段内显著关联的位点仅包含 单一基因Sobic.007G124200， 该基因编码海 藻糖磷酸酶， 命名为SbGS ‑7； 通过设计跨叠引物， PCR扩增、 测序和序列拼接， 获得该基因的 全长基因 组序列； 与BTx623参考基因组比对， 当粒形为圆粒 时， SbGS‑7基因为正常序列， 而当粒形为长粒 时， 该基因在第1个和第2个外显子 分别发生5个位点突变和2个位点突变； 发生在第1个外显 子的第1个突变位点为距翻译起始位点第93位碱基， G突变为T即精氨酸CGG突变为精氨酸 CGT为同义突变； 第2个突变位点为距翻译起始位点第106位碱基， A突变为G即异亮氨酸ATC 突变为缬氨酸GTC为非同义突变； 第3个突变位点为距翻译起始位点第143位碱基处缺失 CCGCCG六个碱基， 导致翻译时缺失2个丙氨 酸； 第4个突变位点为距翻译起始 位点第18 0位碱 基处插入CGG三个碱基， 导致翻译 时多1个精氨酸； 第5个突变位点为距翻译起始位点第268 位碱基， G突变为T即丙氨酸GCC突变为丝氨酸TCC为非 同义突变； 发生在第2个外显子的第1 个突变位点距翻译起始 位点第327位碱基， G突变为T即丙氨 酸GCG突变为丙氨 酸GCT， 为同义 突变； 第2个突变位点距翻译起始位点第351位碱基， G突变为C即缬氨酸GTG突变为缬氨酸 GTC， 为同义 突变。 该基因在第1个内含子分别发生4个位点突变， 第1个突变位点为距翻译起始位点第305 位碱基， C突变为T； 第2个突变位点为距翻译起始位点第329位碱基， G突变为T； 第3个突变位 点为距翻译起始位点第343位碱基， T突变为A； 第4个突变位点为距翻译起始位点第358位碱 基处缺失ATTC四个碱基， 第4个内含子发生 1个位点突变， 突变位点为距翻译起始 位点第925 位碱基处缺失CCAT六个碱基， 第7个内含子发生1个位点突变， 突变位点为距翻译起始位点 第1828位碱基处缺失C CGCCGCCGT十个碱基。 根据第7个内含子内的第1828位碱基处包含 的10个碱基的插入/缺失特性开发了基于 PCR技术的鉴定长/圆粒粒形基因SbGS ‑7的功能分子标记M3； 该标记由引物对M3 ‑F和M3‑R从 高粱基因组DNA中扩增出来的核苷酸序列， 经聚丙烯 酰胺凝胶检测 后， 用于区分高粱长粒和 圆粒类型。 10.一种如权利要求3所述高粱长/圆粒粒形基因SbGS ‑7的功能分子标记在高粱种质资 源的筛选和鉴定以及作为分子标记辅助育种中的应用。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114921472 A 3