(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210500294.9 (22)申请日 2022.04.15 (71)申请人 江苏省中国科 学院植物研究所 地址 210014 江苏省南京市玄武区中山门 外前湖后村1号 申请人 常熟市农业科 学研究所 (72)发明人 刘佳　陆燕　谢鹏飞　朱艳　 孙小芹　唐乐尧　柯瑷　 (74)专利代理 机构 南京北辰联和知识产权代理 有限公司 323 50 专利代理师 陆中丹 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12Q 1/6806(2018.01)C12N 15/11(2006.01) A01H 1/04(2006.01) (54)发明名称 一种水稻抗稻瘟病基因Pi-d2的显性功能分 子标记及其应用 (57)摘要 本发明于分子鉴别和水稻育种领域， 公开了 一种水稻抗稻瘟病Pi ‑d2基因的显性功能分子标 记Pi‑d2SNP， 所述标记由如SEQ  ID NO.3和SEQ   ID NO.4所示的引物对组成。 Pi ‑d2基因第1383位 核苷酸是A还是G， 是区分Pi ‑d2抗病还是感病等 位基因的标记位点。 对18个水稻育成 品种进行验 证， 结果该显性功能分子标记能够 精准区分携带 Pi‑d2抗、 感病等位基因的水稻品种。 本发明以 PCR技术为基础， 操作简单、 稳定可靠， 不仅 能快 速区分水稻品种的基因型， 而且能够直接地实现 Pi‑d2基因在水稻种植资源以及育种后代中的鉴 定， 为定向育种提供快速有效的辅助分子鉴定技 术， 加速传统育种进程。 权利要求书1页 说明书7页 序列表3页 附图2页 CN 114921581 A 2022.08.19 CN 114921581 A 1.一种水稻抗稻瘟病基因Pi ‑d2的显性功能分子标记， 其特征在于， 所述分子标记位于 水稻Pi‑d2基因第1383位核苷 酸， 该位点为A时， 编码异亮氨酸， 为Pi ‑d2抗病等位基因； 该位 点为G时， 编码甲硫氨酸， 为Pi ‑d2感病等 位基因。 2.根据权利要求1所述的分子水稻抗稻瘟病基因Pi ‑d2的显性功能分子标记， 含有所述 分子标记的核苷酸序列如SEQ  ID NO.5所示， 所述的分子标记位于第1383位。 3.根据权利要求1所述的水稻抗稻瘟病基因Pi ‑d2的显性功能分子标记的引物， 其特征 在于， 所述引物序列如下： SEQ ID NO.3： 5’ ‑GCACAATACCATTATTATTGTCATTATA‑3’； SEQ ID NO.4： 5’ ‑GTTGTCGTCA AGTAGAACATTCTCA‑3’。 4.一种检测水稻抗稻瘟病Pi ‑d2基因的方法， 其特征在于， 利用权利要求2所述的引物 对水稻基因 组DNA进行PCR扩增， 根据扩增结果判断所含水稻抗稻瘟病Pi ‑d2基因的基因型。 5.根据权利要求4所述的检测水稻抗稻瘟病Pi ‑d2基因的方法， 其特征在于， 若扩增后 得到长度为616b p的片段， 则待测目标含Pi ‑d2抗病等位基因； 若扩增无条带， 则待测目标含 Pi‑d2感病等 位基因。 6.根据权利 要求4所述的检测水稻 抗稻瘟病Pi ‑d2基因方法， 其特征在于， 所述PCR扩增 反应体系各组分及体积为： 10 ×PCR缓冲液2.5 μL， dNTPs  2.0 μL， DNA模板2.0 μL， 引物各1.0 μ L， Taq DNA聚合酶0.15 μL， 最后用去离 子水补足至25 μL。 7.根据权利 要求4所述的检测水稻 抗稻瘟病Pi ‑d2基因方法， 其特征在于， 扩增程序为： 95℃， 3min预变性； 95℃变性15s， 58℃退火15s， 72℃延伸3min， 35个循环； 最后72℃延伸 5min。 PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳， 电压120V， 电泳0.5h后用凝胶成像系统观察、 拍 照， 以DL20 00为DNA marker。 8.根据权利 要求4所述的检测水稻 抗稻瘟病Pi ‑d2基因方法， 其特征在于， 提取DNA的方 法为： (1)2×CTAB， 60℃预热； 异丙醇， ‑20℃预冷； (2)水稻叶片放入液氮冷冻5mi n， 经高速组织研磨机Tis s‑48型将样品进行破碎； (3)加入预 热的2×CTAB抽提缓冲液， 6 5℃水浴40～6 0min， 每隔10mi n取出摇匀一次； (4)冷却至室温， 加入氯仿摇匀， 5mi n后离心， 抽提去除蛋白质； (5)10000rpm室温离心12mi n， 取上清液于 离心管中； (6)加入预冷的异丙醇， 轻 轻混匀，‑20℃冰箱中放置2h以上； (7)10000rpm室温离心12mi n， 小心去上清液； (8)用70％乙醇洗涤沉淀DNA 2次， 10000rpm室温离心1mi n， 去上清； (9)在通风橱或室温干燥； (10)沉淀溶于 50uL去离子水中， 可加入RNAase， 于 ‑20℃保存备用。 9.含有权利要求3所述引物的试剂或试剂盒。 10.权利要求1所述水稻抗稻瘟病基因Pi ‑d2的显性功能分子标记或权利要求3所述引 物在水稻种质资源的筛 选和鉴定或分子标记辅助育种中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114921581 A 2一种水稻抗稻瘟病基因Pi ‑d2的显性功能分子标记及其应用 技术领域 [0001]本发明属于分子鉴别和 水稻育种领域， 涉及水稻抗稻瘟病基因Pi ‑d2的显性功能 分子标记及其应用。 背景技术 [0002]稻瘟病是由稻瘟病菌(Magnaporthe  grisea)引起的一种极具破坏性的水稻病害， 全球每年因稻瘟病害可减产10％～30％。 从环境保护与农业可持续发展考虑， 利用寄主抗 性， 选育和种植稻瘟病抗性品种 是防治稻瘟病最安全有效的方法。 传统抗性品种选育一般 依靠表型鉴定， 且需要加大群体规模和增加 鉴定批次以减少环境和人为因素 的影响， 这极 大地增加了抗性育种的工作量与成本。 利用已克隆的稻瘟病抗性基因的连锁 标记或功能基 因标记， 从分子水平跟踪目标基因， 选择含有目标抗性基因的单株进 行杂交或回交， 不仅能 精准指导 抗病性状的定向改良， 并且能减少杂交或回交群 体的大小， 节省成本 。 [0003]目前针对P i‑d2基因的分子标记辅助育种所开发的分子标记主要为： 一是与Pi ‑d2 紧密连锁标记(CN 1306041C)， 但这类标记存在鉴定步骤复杂、 特异性较差等缺陷， 且需要依 赖构建相应F2群体才能使用， 影响标记利用效率。 二是针对Pi ‑d2基因开发的功能型分子标 记(CN103409417B)， 但使用该标记引物扩增片段后需经酶切反应确定其基因型， 增加鉴定 成本。 为了加快Pi ‑d2基因在抗稻瘟病育种中的应用， 迫切需要开发Pi ‑d2更加高效的显性 功能分子标记并应用于分子 育种中。 发明内容 [0004]为了解决现有技术中存在的问题， 本发明提供一种基于水稻抗稻瘟病基因Pi ‑d2 的显性功能分子标记及其引物序列， 应用于水稻抗稻瘟病分子标记辅助育种， 加快选育广 谱高抗稻瘟病水稻新品种。 [0005]为达到上述目的， 本发明采用的技 术方案如下： [0006]本发明针对Pi ‑d2基因第1383位碱基(抗病A/ 感病G)， 开发了一种新的水稻抗稻瘟 病基因Pi ‑d2的显性功能分子标记， 在分子标记辅助育种中准确鉴定目标个体的基因型， 大 幅提高选育效率。 Pi ‑d2基因在第6号染色体着 丝点附近， 以单拷贝形式存在， 隶属于凝集素 类受体激酶家族， Pi ‑d2基因抗感差异是由于第1383位碱基突变而引起的氨基酸突变所决 定的， 具体来说， 当该位点的A突变为G， 其所编码的异亮氨酸(Ile)突变为甲硫氨酸(Met)， 导致Pi‑d2蛋白的跨膜结构域发生显著变异， 不能将配体识别信息从细胞外空间传递到细 胞内的激酶结构域， 从而导致水稻感病。 因此， 461位的氨基酸是Ile还 是Met， 即对应的碱基 是A还是G， 成为区分Pi ‑d2抗病还是感病等 位基因的标记。 [0007]本发明首先根据参考水稻品种日本晴基因组， 设计Pi ‑d2基因全长引物， SEQ  ID  NO.1： GTTTGAGACCCCTCATAAGATTC和SEQ  ID NO.2： AACCTAACTAGA CAAGGCACTGTA， 对 不同遗传 背景的水稻品种进行PCR扩增和测序。 利用Clustal  W序列比对程序， 对 所有检测水稻的Pi ‑ d2基因核苷酸序列进行比对， 结果如图1所示。 与前人报道一致， 与稻瘟病抗性相关的第说　明　书 1/7 页 3 CN 114921581 A 3