(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210391221.0 (22)申请日 2022.04.14 (71)申请人 中国科学院遗传与发育生物学研究 所 地址 100101 北京市朝阳区北辰西路1号院 (72)发明人 石文文　张永清　 (74)专利代理 机构 中科专利商标代理有限责任 公司 11021 专利代理师 乔献丽　张莹 (51)Int.Cl. C12N 15/11(2006.01) C12N 15/85(2006.01) C12N 15/65(2006.01) A01K 67/027(2006.01) (54)发明名称 犬Rosa26 基因及其应用 (57)摘要 本发明涉及犬Rosa26基因及其在定点插入 外源基因到犬基因组 中的应用， 所述犬Ro sa26基 因全长非编码RNA对应的cDNA序列如SEQ  ID NO: 1所示， 所述犬Ro sa26的基因序列如SEQ  ID NO:2 所示。 本发 明还提供了将外源基因定点插入犬基 因组的方法， 经验证， 外源基因获得了稳定持续 的表达， 该方法在基础科学研究和犬类品种品质 改良方面具有潜在的应用价值， 填补了目前犬基 因组中定点插 入外源基因技 术的空白。 权利要求书1页 说明书9页 序列表21页 附图4页 CN 114891786 A 2022.08.12 CN 114891786 A 1.分离的犬Rosa26基因， 其特征在于： 所述犬Rosa26基因包含犬Rosa26基因全长非编 码RNA对应的cDNA序列， 所述Rosa26基因全长非编码RNA对应的cDNA序列如SEQ  ID NO:1所 示， 或与SEQ  ID NO:1所示序列具有至少70％、 71％、 72％、 73％、 74％、 75％、 76％、 77％、 78％、 79％、 80％、 81％、 82％、 83％、 84％、 85％、 86％、 87％、 88％、 89％、 90％、 91％、 92％、 93％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％、 9 9％的序列同一 性。 2.根据权利 要求1所述的分离的犬Rosa26基因， 其特征在于： 所述犬Rosa26的基因序列 如SEQ ID NO:2所示， 或与SEQ  ID NO:2所示序列具有至少70％、 71％、 72％、 73％、 74％、 75％、 76％、 77％、 78％、 79％、 80％、 81％、 82％、 83％、 84％、 85％、 86％、 87％、 88％、 89％、 90％、 91％、 9 2％、 93％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％、 9 9％的序列同一 性。 3.将外源基因定点插 入犬基因 组的方法， 其特 征在于包括以下步骤： (a)针对根据权利要求1或2所述的分离的犬Rosa26的基因序列设计sgRNA序列， 将 sgRNA所对应的DNA序列连入 含有sgRNA骨架序列的质粒中； (b)将PCR扩增获得的外源基因序列、 根据权利要求1所述的分离 的犬Rosa26基因同源 重组的左臂核苷酸序列、 根据权利要求1所述的分离的犬Rosa26基因同源重组的右臂核苷 酸序列与扩增载体连接， 获得同源重组的供体载体； (c)将步骤(a)所得的质粒、 步骤(b)所得的供体载体和含有Cas9的质粒共同转染犬体 细胞； (d)采用PCR鉴定5 ’端同源重组结果和3 ’端同源重组结果， 若PCR产物与预期相符， 则表 明已将外源基因定点插 入犬基因 组。 4.根据权利要求3所述的将外源基因定点插入犬基因组的方法， 其中所述sgRNA序列的 靶向序列如SEQ  ID NO:4所示。 5.根据权利要求3或4所述的将外源基因定点插入犬基因组的方法， 其中含有sgRNA骨 架序列的质粒选自： ad dgene#51133质粒， ad dgene#42 230质粒和ad dgene#58778质粒。 6.根据权利要求3 ‑5中任一项所述的将外源基因定点插入犬基因组的方法， 其中所述 犬Rosa26基因同源重组的左臂核苷酸序列如SEQ  ID NO:7所示， 任选地所述犬Rosa26基因 同源重组的右 臂核苷酸序列如SEQ  ID NO:8所示。 7.根据权利要求3 ‑6中任一项所述的将外源基因定点插入犬基因组的方法， 其中所述 扩增载体选自： ad dgene#61408质粒， ad dgene#22677质粒和ad dgene#51132质粒。 8.根据权利要求3 ‑7中任一项所述的将外源基因定点插入犬基因组的方法， 其中含有 Cas9的质粒选自： ad dgene#44758质粒， ad dgene#42 230质粒和ad dgene#973 07质粒。 9.根据权利要求1或2所述的分离的犬Rosa26基因在将外源基因定点插入犬基因组中 的应用。 10.根据权利要求1或2所述的分离的犬Rosa26基因在将外源基因定点插入犬基因组的 转基因细胞模型和动物模型的构建或在犬中过表达或功能研究中或在犬育种中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114891786 A 2犬Rosa26基因及其应用 技术领域 [0001]本发明涉及生物技术领域， 具体涉及犬Rosa26基因及其在 定点插入外源基因到犬 基因组中的应用， 更具体涉及在犬基因组中定点插入外源基因或DNA片段并使其稳定表达 的方法， 及其在基础科 学研究和动物品种品质改良方面的应用。 背景技术 [0002]犬作为一种常见的家养动 物和历史悠久的实验动 物， 既是人类生产生活过程中不 可或缺的伙伴， 也在科学研究中发挥过重要的作用。 在生产生活实践中， 不同品种的犬在不 同地域、 不同行业、 不同人群中都发挥着重要的作用。 在科学研究中， 犬作为实验动物最为 著名的贡献当属在条件反射理论的建立(1904年诺贝尔生理或医学奖)和胰岛素的发现 (1923年诺贝尔生理或 医学奖)中所起到的作用。 近年来， 随着科学技术的进步和需求， 越来 越多的大动物例如 犬被应用于很多 科学研究， 尤其是学习、 社 交、 认知等神经科学的研究之 中。 然而使用犬作为科学研究模式动物的很多技术方法手段还没有被很好的开发出来， 定 点插入外源基因到犬基因 组的方法就是其中之一。 [0003]在基因组中插入外源基因一般有随机插入和定点插入两种方法， 目前国际上有报 道的将外源基因插入到犬基因组的案例分别为2009年构建 的荧光蛋白基因插入犬和2014 年构建的阿尔兹海默症基因插入犬， 所采用的方法均为传统的随机插入的方法(Hong, S.G.,Kim,M.K.,Jang,G.,Oh,H.J.,Park,J.E.,K ang,J.T.,Koo,O.J.,Kim,T.,Kwon,M.S., Koo,B.C.,et  al.(2009).Generation  of red fluorescent  protein transgenic   dogs.Genesis  47,314‑322； Lee,G. ‑S.,Jeong,Y.W.,Kim,J.J.,Park,S.W.,Ko,K.H.,Kang, M.,Kim,Y.K.,Jung,E. ‑M.,Moon,C.,Hyun,S.H.,et  al.(2014).A  canine model of  Alzheimer's  disease generated  by overexpressing  a mutated human amyloid  precursor  protein.International  Journal of Molecular  Medicine  33,1003‑1012)。 传统的将外源基因随机插入基因组的方法， 通常会产生以下问题： 第一， 由于外源基因插入 基因组的位置是随机的、 不可预知的， 因此有潜在的风险， 造成动物基因组的插入突变以及 基因组的不稳定， 对动物自身造成一些生理上的危害或导致一些非特异 性的表型； 第二， 插 入基因的拷贝数不可控； 第三， 由于插入位点的随机性， 使得外源基因不能持续稳定表达， 并且其遗传稳定性较差。 因此， 在技术允许的情况下， 不管是在基础科学研究领域， 还是在 经济动物品种品质改良方面， 将外源基因定点插入基因组特定位点都是一种 更为安全、 可 靠和具有实用价 值的技术。 [0004]本发明提供了针对犬基因组的特定插入位点基因Rosa26及在该位点插入外源基 因并使其稳定持续表达的方法， 阐述了该方法在基础科学研究和犬类品种品质改良方面的 潜在应用价 值， 填补了目前犬基因 组中定点插 入外源基因技 术的空白。 发明内容 [0005]本发明提供犬Rosa26基因及特异性插入位点， 以解决外源基因随机插入犬基因组说　明　书 1/9 页 3 CN 114891786 A 3